作者McRay (文昌帝君)
看板Biotech
標題[討論] 有關E.coli是否會踢掉plasmid的問題
時間Fri Aug 13 21:51:37 2010
版上各位朋友
小弟最近正在做cloning ，正好做到從LB/Amp plate中挑選colony 做 PCR
確定是否有DNA insert。
我的方式是用10 ul的 tip 點菌接種到 20ul 的 LB中，在37度中培養一小時後
取1ul菌液做PCR，計畫再將確定有夾出片段的菌落取至LB/Amp中養大抽plasmid。
菌在LB only中37度培養一小時後,放在四度冰箱一天
後來我的同事告訴我這可能會導致E.coli將plasmid踢掉，因為環境失去了
Amp選擇的壓力；後來我又補了50ug/ml的Amp使其在四度中放置兩天
請問大家，這樣處理的菌如果真能在2ml LB/Amp中長起來(取1ul菌液在2ml LB/Amp養)，
會不會抽不到plasmid?
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◆ From: 111.82.118.201
1F：→ gryou:我不清楚這樣會不會踢掉 我都是抽小量 用enzyme來確認的 08/13 22:25
2F：→ gryou:而我的作法是 養菌完後 馬上離心 除LB上清液後 丟-20度冰箱 08/13 22:27
3F：→ gryou:目前是都抽的出來！！也沒踢掉的問題！ 08/13 22:28
4F：→ gryou:小量：6ml LB + 100 μg/ml Amp (會保留1ml作菌種) 08/13 22:30
5F：→ skyken10:當E.coli繼續複製之後~子代的plasmid會快速的降低 08/14 01:10
6F：→ skyken10:而原本的E.coli應該不會lose掉plasmid~! 08/14 01:11
7F：→ match308:踢掉plasmid的細菌不就長不起來了嗎,長得起來就只剩有的 08/14 13:21
8F：→ bill90128:良心建議:做實驗還是一口氣做完比較好。放來放去的實驗 08/15 00:22
9F：→ bill90128:品質難以控制。萬一實驗失敗了，要追蹤也不好追。 08/15 00:23
10F：推 yaliu:我的作法是，colony+10ul LB+Ap，直接colony PCR（取1ul） 08/15 01:15
11F：→ yaliu:接著再加1ml的LB+Ap，養隔夜...隔天應該就知道哪個要哪個不 08/15 01:16
12F：→ yaliu:要了吧 08/15 01:16
13F：→ yaliu:所以我一開始就放在1.5ml epp.裡面～我覺得還蠻方便的 08/15 01:17
14F：→ McRay:感謝各位! 星期一抽的結果會跟大家報告的 08/15 01:23
15F：推 spirithorse:直接用滅菌牙籤點菌後,先沾到Amp plate,再沾到PCRtube 08/15 02:21
16F：→ spirithorse:做colony PCR,然後就可以拿到PCR結果和有號碼的plate 08/15 02:22
17F：→ spirithorse:Amp只是抑制菌的生長,不會殺死菌,所以放久會有雜菌 08/15 02:23