作者McRay (文昌帝君)
看板Biotech
标题[讨论] 有关E.coli是否会踢掉plasmid的问题
时间Fri Aug 13 21:51:37 2010
版上各位朋友
小弟最近正在做cloning ，正好做到从LB/Amp plate中挑选colony 做 PCR
确定是否有DNA insert。
我的方式是用10 ul的 tip 点菌接种到 20ul 的 LB中，在37度中培养一小时後
取1ul菌液做PCR，计画再将确定有夹出片段的菌落取至LB/Amp中养大抽plasmid。
菌在LB only中37度培养一小时後,放在四度冰箱一天
後来我的同事告诉我这可能会导致E.coli将plasmid踢掉，因为环境失去了
Amp选择的压力；後来我又补了50ug/ml的Amp使其在四度中放置两天
请问大家，这样处理的菌如果真能在2ml LB/Amp中长起来(取1ul菌液在2ml LB/Amp养)，
会不会抽不到plasmid?
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所有技术上的努力都要由关心人类和其命运出发
为了让人类心智的创造物有益而不是有害
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.82.118.201
1F：→ gryou:我不清楚这样会不会踢掉 我都是抽小量 用enzyme来确认的 08/13 22:25
2F：→ gryou:而我的作法是 养菌完後 马上离心 除LB上清液後 丢-20度冰箱 08/13 22:27
3F：→ gryou:目前是都抽的出来！！也没踢掉的问题！ 08/13 22:28
4F：→ gryou:小量：6ml LB + 100 μg/ml Amp (会保留1ml作菌种) 08/13 22:30
5F：→ skyken10:当E.coli继续复制之後~子代的plasmid会快速的降低 08/14 01:10
6F：→ skyken10:而原本的E.coli应该不会lose掉plasmid~! 08/14 01:11
7F：→ match308:踢掉plasmid的细菌不就长不起来了吗,长得起来就只剩有的 08/14 13:21
8F：→ bill90128:良心建议:做实验还是一口气做完比较好。放来放去的实验 08/15 00:22
9F：→ bill90128:品质难以控制。万一实验失败了，要追踪也不好追。 08/15 00:23
10F：推 yaliu:我的作法是，colony+10ul LB+Ap，直接colony PCR（取1ul） 08/15 01:15
11F：→ yaliu:接着再加1ml的LB+Ap，养隔夜...隔天应该就知道哪个要哪个不 08/15 01:16
12F：→ yaliu:要了吧 08/15 01:16
13F：→ yaliu:所以我一开始就放在1.5ml epp.里面～我觉得还蛮方便的 08/15 01:17
14F：→ McRay:感谢各位! 星期一抽的结果会跟大家报告的 08/15 01:23
15F：推 spirithorse:直接用灭菌牙签点菌後,先沾到Amp plate,再沾到PCRtube 08/15 02:21
16F：→ spirithorse:做colony PCR,然後就可以拿到PCR结果和有号码的plate 08/15 02:22
17F：→ spirithorse:Amp只是抑制菌的生长,不会杀死菌,所以放久会有杂菌 08/15 02:23