※ 引述《boblu (六百)》之銘言： : 囧 cloning 真的不是我的強項 囧 : 手上有一個片段 (8xx bp) 已經以 TA cloning 放到 vector 裡面 : 要轉到另外一個 expression vector (pCS2+, 兩生類與魚類用的, 3xxx bp） : TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆為唯一）夾在中間 : expression vector 上的 MCS 當然也是有這兩個 site : pCS2+ 跟 TA construct 同時作 double digest 以後 : pCS2+ CIP 一小時（double digest 應該沒必要 CIP？想說有作有安心） : 在 gel 上有看到 insert 被 release 出來 : --> pCS2+ 的 double digest 應該也是成功的吧？ 請問TA+insert的質體，應該切得很乾淨吧？ gel上有看到沒切成功的雜band嗎？ : gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫爾比大約3:1）作 ligation : control 就是用水代替 insert : 用的是 Takara 的 kit 2.1 : O/N 以後取一半的 ligation product 丟 Invitrogen 的 competent cell : 結果： : vector only 的那一組長得比有 insert 的還多 囧 有多很多嗎？？ 其實我想知道，你轉型完之後，是怎麼塗plate的，一片大概長幾顆colonies 有跟做TA時的情形差不多嗎？colonies數目.... 如果vector沒有切成功或切一刀，他自己self-ligation的機率很高 這樣plate應該長滿滿的吧.... 雖然你有做了CIP，可以屏除掉只切一刀的self-ligation 但CIP也不一定百分百成功。 我以前vector切兩刀沒做CIP，vector only的機率超級低，至少我沒有挑到 其實看你的敘述，pCS2+/BamHI,EcoRI製備本身就很有問題 如果確定你的酵素沒有問題的話 那可能出在vector本身了 到底vector有沒有EcoRI及BamHI切點？然後他的DNA品質好不好？ 看你的敘述好像這個材料不是你自己製備的，可以去確認看看是不是人家vector沒給你錯 （也是有可能發生來來源材料不正確的情況的....） 在轉型確認無問題的前提下 至少在vector only的測試，轉型後菌落要非常少 （我想應該要沒有啦～不過我之前切兩刀也沒做這個動作所以沒辦法百分百保證） 確定你ligation前的步驟沒有問題 之後如果還是沒接成功，再去考慮ligation這個步驟 看看是否要換ligase之類的 再沒成功（應該就是沒什麼colony長），那只能猜測這個基因表現的蛋白 host cell不喜歡吧.... 如果時間跟錢很夠的話，改作別的基因看看是不是真的你要接的基因host不喜歡XD 以上小小淺見，給你參考^^ --

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