※ 引述《boblu (六百)》之铭言： : 囧 cloning 真的不是我的强项 囧 : 手上有一个片段 (8xx bp) 已经以 TA cloning 放到 vector 里面 : 要转到另外一个 expression vector (pCS2+, 两生类与鱼类用的, 3xxx bp） : TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆为唯一）夹在中间 : expression vector 上的 MCS 当然也是有这两个 site : pCS2+ 跟 TA construct 同时作 double digest 以後 : pCS2+ CIP 一小时（double digest 应该没必要 CIP？想说有作有安心） : 在 gel 上有看到 insert 被 release 出来 : --> pCS2+ 的 double digest 应该也是成功的吧？ 请问TA+insert的质体，应该切得很乾净吧？ gel上有看到没切成功的杂band吗？ : gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫尔比大约3:1）作 ligation : control 就是用水代替 insert : 用的是 Takara 的 kit 2.1 : O/N 以後取一半的 ligation product 丢 Invitrogen 的 competent cell : 结果： : vector only 的那一组长得比有 insert 的还多 囧 有多很多吗？？ 其实我想知道，你转型完之後，是怎麽涂plate的，一片大概长几颗colonies 有跟做TA时的情形差不多吗？colonies数目.... 如果vector没有切成功或切一刀，他自己self-ligation的机率很高 这样plate应该长满满的吧.... 虽然你有做了CIP，可以屏除掉只切一刀的self-ligation 但CIP也不一定百分百成功。 我以前vector切两刀没做CIP，vector only的机率超级低，至少我没有挑到 其实看你的叙述，pCS2+/BamHI,EcoRI制备本身就很有问题 如果确定你的酵素没有问题的话 那可能出在vector本身了 到底vector有没有EcoRI及BamHI切点？然後他的DNA品质好不好？ 看你的叙述好像这个材料不是你自己制备的，可以去确认看看是不是人家vector没给你错 （也是有可能发生来来源材料不正确的情况的....） 在转型确认无问题的前提下 至少在vector only的测试，转型後菌落要非常少 （我想应该要没有啦～不过我之前切两刀也没做这个动作所以没办法百分百保证） 确定你ligation前的步骤没有问题 之後如果还是没接成功，再去考虑ligation这个步骤 看看是否要换ligase之类的 再没成功（应该就是没什麽colony长），那只能猜测这个基因表现的蛋白 host cell不喜欢吧.... 如果时间跟钱很够的话，改作别的基因看看是不是真的你要接的基因host不喜欢XD 以上小小浅见，给你参考^^ --

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