我確實有遇過vector only 長得比 vector + insert 多的 印象中還不只一次 命中率倒也不低 不過你說挑了30幾顆都沒中.... 肯定是哪裡有出錯了 做法看起來是沒啥問題... 找不到問題的亂猜測就是....clone的基因是毒蛋白嗎？會影響e.coli生長嗎 (但如果是用cloning用的e.coli strain的話，就算是也不會表現啊...^^") 無建設性的回文... 囧" ※ 引述《boblu (六百)》之銘言： : 囧 cloning 真的不是我的強項 囧 : 手上有一個片段 (8xx bp) 已經以 TA cloning 放到 vector 裡面 : 要轉到另外一個 expression vector (pCS2+, 兩生類與魚類用的, 3xxx bp） : TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆為唯一）夾在中間 : expression vector 上的 MCS 當然也是有這兩個 site : pCS2+ 跟 TA construct 同時作 double digest 以後 : pCS2+ CIP 一小時（double digest 應該沒必要 CIP？想說有作有安心） : 在 gel 上有看到 insert 被 release 出來 : --> pCS2+ 的 double digest 應該也是成功的吧？ : gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫爾比大約3:1）作 ligation : control 就是用水代替 insert : 用的是 Takara 的 kit 2.1 : O/N 以後取一半的 ligation product 丟 Invitrogen 的 competent cell : 結果： : vector only 的那一組長得比有 insert 的還多 囧 : 這種事發生不只一次了 實在已經想不出還漏了什麼？ --

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