我确实有遇过vector only 长得比 vector + insert 多的 印象中还不只一次 命中率倒也不低 不过你说挑了30几颗都没中.... 肯定是哪里有出错了 做法看起来是没啥问题... 找不到问题的乱猜测就是....clone的基因是毒蛋白吗？会影响e.coli生长吗 (但如果是用cloning用的e.coli strain的话，就算是也不会表现啊...^^") 无建设性的回文... 囧" ※ 引述《boblu (六百)》之铭言： : 囧 cloning 真的不是我的强项 囧 : 手上有一个片段 (8xx bp) 已经以 TA cloning 放到 vector 里面 : 要转到另外一个 expression vector (pCS2+, 两生类与鱼类用的, 3xxx bp） : TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆为唯一）夹在中间 : expression vector 上的 MCS 当然也是有这两个 site : pCS2+ 跟 TA construct 同时作 double digest 以後 : pCS2+ CIP 一小时（double digest 应该没必要 CIP？想说有作有安心） : 在 gel 上有看到 insert 被 release 出来 : --> pCS2+ 的 double digest 应该也是成功的吧？ : gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫尔比大约3:1）作 ligation : control 就是用水代替 insert : 用的是 Takara 的 kit 2.1 : O/N 以後取一半的 ligation product 丢 Invitrogen 的 competent cell : 结果： : vector only 的那一组长得比有 insert 的还多 囧 : 这种事发生不只一次了 实在已经想不出还漏了什麽？ --

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