作者honeytea96 ()
看板Biotech
標題[求救] cloning實驗做到digest gelpurification就做不出來>"<
時間Sun Aug 8 00:58:24 2010
小妹我目前在做關於cloning及biosensor相關的實驗
一開始做PCR 用proof reading Taq做了好幾次都鬼打牆 量非常少
後來老師可以用普通的Taq做 目前做出最好的情形大概是以下的照片
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868394307/in/photostream/
三個sample都是P recA 基因
後來純化將三管混合作 PCR product的purification 圖大概是這樣(從右邊數來第二個)
(PCR純化我是用kit作 最後Elution solution的量是加12ul)
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868396741/in/photostream/
(不知道為什麼變比較淡~"~)
後來繼續作到BamHI和XbaI的double digest 以下是digest program
[insert] [vector]
volume(uL)
buffer3 3 3
BSA 3 3
insert 8 5
BamHI 0.3 0.3
XbaI 0.3 0.3
dH2O 15.4 18.4
這是digest overnight 後的圖(抱歉已經切過膠)
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869015092/in/photostream/
中間第二到第四個由左至右算起分別是
vector.insert.100bp marker. 1kb marker
經過切膠之後 用kit作purification 結果照出來就完全沒東西了Q_Q
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869017390/in/photostream/
已經經過了大概3次重複整個實驗過程
都是到最後沒辦法作到ligation的部份
雖然我覺得是後來digestion之後量變少
但真的事要量夠多到後來純化過colum跑膠才看的到嗎
希望各位大大能給一些意見喔 謝謝!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.223.238
※ 編輯: honeytea96 來自: 61.230.223.238 (08/08 00:59)
※ 編輯: honeytea96 來自: 61.230.223.238 (08/08 01:01)
1F：→ match308:your album is private, not publicly accessible 08/08 03:01
2F：→ honeytea96:>"< sorry~~~已更正 08/08 17:09
3F：→ gryou:試著利用TA-cloning 放大 insert ，vector 也多一點去切！！ 08/08 19:06
4F：→ gryou:之前我也是在切完膠後純化 發現效率很差 出來最多剩60% 08/08 19:07
5F：→ match308:為什麼gel extraction之後還要再跑一次gel呢?不就切你要 08/08 21:09
6F：→ match308:的band,做完gel extraction就可以拿去digest了嗎 08/08 21:10
7F：→ blence:"Elution solution的量是加12ul"...是哪一牌的kit這麼厲害? 08/08 21:29
8F：→ honeytea96:回M大 我的程序大概是PCR=>跑膠看band=>purification 08/08 23:27
9F：→ honeytea96:=>跑膠=>digestion=>全load切膠=>純化(目前是這樣) 08/08 23:30
10F：→ match308:嗯,我的意思是你第一次gel purification之後,拿到DAN就可 08/09 00:15
11F：→ match308:以拿去切了,你只cut right band的話大部分DNA都會是好的 08/09 00:17
12F：→ match308:不需要在做一次purification,每做一次conc就少一半 08/09 00:18
13F：→ match308:不太懂為什麼每次你的purification後還要跑膠,那跑膠後 08/09 01:24
14F：→ match308:DNA又要怎麼extract? 08/09 01:24
15F：→ honeytea96:恩,因為我PCR過後是直接過colume純化 沒有經過切膠再 08/09 01:57
16F：→ honeytea96:gel purification的步驟 我也在想是不是就直接把所有的 08/09 01:59
17F：→ honeytea96:PCR product全部load膠切膠再純化 因為PCR本身primer 08/09 02:00
18F：→ honeytea96:dimer也很多 但是之後digestion還是要經過一次切膠純化 08/09 02:01
19F：→ honeytea96:還是有其他方法可以使純化次數減少? 08/09 02:02
20F：→ honeytea96:或是直接拿digestion product去作ligation 不知道這樣 08/09 02:07
21F：→ honeytea96:可不可行??@@ 08/09 02:07
22F：推 mattmatt:PCR效率看起來頗差..直接P genomic DNA嗎?template量? 08/09 02:24
23F：→ mattmatt:看能不能想辦法P多一點...但還是建議gryou大說的, 08/09 02:25
24F：→ mattmatt:先用TA cloning,放大片段再下去切,量多又純又可定序 08/09 02:27
25F：→ mattmatt:你的方法一開始PCR產物量就少了 而過一次純化kit會少50% 08/09 02:28
26F：→ mattmatt:kit只用12ul elute雖然濃度會高一點 但elute的總量會更少 08/09 02:28
27F：推 match308:大概懂你怎麼做的了,第二張圖顯示你PCR purification kit 08/09 02:29
28F：→ match308:也沒辦法把primers濾掉,不如就全部直接load做gel purify 08/09 02:30
29F：→ mattmatt:最後就會少到無法做後續 08/09 02:30
30F：→ mattmatt:可以PCR多個五六管一起load膠做Gel purification 08/09 02:31
31F：→ mattmatt:elute用35~40左右 然後直接digestion 但ligation可能不 08/09 02:32
32F：→ match308:=>digestion=>gel purify=>ligation,我沒做過切完後不純 08/09 02:33
33F：→ mattmatt:適合RE的酵素 還是純化比較好 (但量又會更少 囧) 08/09 02:33
34F：→ match308:化的,可能可行但至少要heat inactivate吧 08/09 02:34
35F：→ honeytea96:回mattmatt大 我是P Ecoli K12的genomic DNA沒錯 08/09 09:20
36F：→ honeytea96:量是加4ul(濃度50ng/ul) cycle數是40 所以還是量太少 08/09 09:22
37F：→ honeytea96:嗎@@ 總之我會照mattmatt大&match308大的建議去做做看 08/09 09:23
38F：→ honeytea96:的!!! 謝謝大家的回應~!! 08/09 09:23
39F：→ tsubasawolfy:不能改善PCR的條件增加產量看看嗎@@? 08/09 10:26
40F：→ honeytea96:大概已經作了十次以上的PCR 這個大概是最好的條件了@@ 08/09 22:14
41F：推 huhu126:PCR的效率確實不好,但gel purification的效果也不好.... 08/09 22:26
42F：→ huhu126:可以試著提高gel濃度,跑開一點再切膠嗎?我覺得問題不在於 08/09 22:29
43F：→ huhu126:PCR產量(如前幾位所言,用個4,5管也就夠了),問題在於純化不 08/09 22:30
44F：推 huhu126:純化效果差,可以loading 60ul PCR product,純化時加25ul 08/09 22:35
45F：→ huhu126:ddH2O之類的,或是換個kit純化(要個試用品,看哪個合適也行) 08/09 22:37