作者honeytea96 ()
看板Biotech
标题[求救] cloning实验做到digest gelpurification就做不出来>"<
时间Sun Aug 8 00:58:24 2010
小妹我目前在做关於cloning及biosensor相关的实验
一开始做PCR 用proof reading Taq做了好几次都鬼打墙 量非常少
後来老师可以用普通的Taq做 目前做出最好的情形大概是以下的照片
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868394307/in/photostream/
三个sample都是P recA 基因
後来纯化将三管混合作 PCR product的purification 图大概是这样(从右边数来第二个)
(PCR纯化我是用kit作 最後Elution solution的量是加12ul)
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868396741/in/photostream/
(不知道为什麽变比较淡~"~)
後来继续作到BamHI和XbaI的double digest 以下是digest program
[insert] [vector]
volume(uL)
buffer3 3 3
BSA 3 3
insert 8 5
BamHI 0.3 0.3
XbaI 0.3 0.3
dH2O 15.4 18.4
这是digest overnight 後的图(抱歉已经切过胶)
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869015092/in/photostream/
中间第二到第四个由左至右算起分别是
vector.insert.100bp marker. 1kb marker
经过切胶之後 用kit作purification 结果照出来就完全没东西了Q_Q
http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869017390/in/photostream/
已经经过了大概3次重复整个实验过程
都是到最後没办法作到ligation的部份
虽然我觉得是後来digestion之後量变少
但真的事要量够多到後来纯化过colum跑胶才看的到吗
希望各位大大能给一些意见喔 谢谢!!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.223.238
※ 编辑: honeytea96 来自: 61.230.223.238 (08/08 00:59)
※ 编辑: honeytea96 来自: 61.230.223.238 (08/08 01:01)
1F：→ match308:your album is private, not publicly accessible 08/08 03:01
2F：→ honeytea96:>"< sorry~~~已更正 08/08 17:09
3F：→ gryou:试着利用TA-cloning 放大 insert ，vector 也多一点去切！！ 08/08 19:06
4F：→ gryou:之前我也是在切完胶後纯化 发现效率很差 出来最多剩60% 08/08 19:07
5F：→ match308:为什麽gel extraction之後还要再跑一次gel呢?不就切你要 08/08 21:09
6F：→ match308:的band,做完gel extraction就可以拿去digest了吗 08/08 21:10
7F：→ blence:"Elution solution的量是加12ul"...是哪一牌的kit这麽厉害? 08/08 21:29
8F：→ honeytea96:回M大 我的程序大概是PCR=>跑胶看band=>purification 08/08 23:27
9F：→ honeytea96:=>跑胶=>digestion=>全load切胶=>纯化(目前是这样) 08/08 23:30
10F：→ match308:嗯,我的意思是你第一次gel purification之後,拿到DAN就可 08/09 00:15
11F：→ match308:以拿去切了,你只cut right band的话大部分DNA都会是好的 08/09 00:17
12F：→ match308:不需要在做一次purification,每做一次conc就少一半 08/09 00:18
13F：→ match308:不太懂为什麽每次你的purification後还要跑胶,那跑胶後 08/09 01:24
14F：→ match308:DNA又要怎麽extract? 08/09 01:24
15F：→ honeytea96:恩,因为我PCR过後是直接过colume纯化 没有经过切胶再 08/09 01:57
16F：→ honeytea96:gel purification的步骤 我也在想是不是就直接把所有的 08/09 01:59
17F：→ honeytea96:PCR product全部load胶切胶再纯化 因为PCR本身primer 08/09 02:00
18F：→ honeytea96:dimer也很多 但是之後digestion还是要经过一次切胶纯化 08/09 02:01
19F：→ honeytea96:还是有其他方法可以使纯化次数减少? 08/09 02:02
20F：→ honeytea96:或是直接拿digestion product去作ligation 不知道这样 08/09 02:07
21F：→ honeytea96:可不可行??@@ 08/09 02:07
22F：推 mattmatt:PCR效率看起来颇差..直接P genomic DNA吗?template量? 08/09 02:24
23F：→ mattmatt:看能不能想办法P多一点...但还是建议gryou大说的, 08/09 02:25
24F：→ mattmatt:先用TA cloning,放大片段再下去切,量多又纯又可定序 08/09 02:27
25F：→ mattmatt:你的方法一开始PCR产物量就少了 而过一次纯化kit会少50% 08/09 02:28
26F：→ mattmatt:kit只用12ul elute虽然浓度会高一点 但elute的总量会更少 08/09 02:28
27F：推 match308:大概懂你怎麽做的了,第二张图显示你PCR purification kit 08/09 02:29
28F：→ match308:也没办法把primers滤掉,不如就全部直接load做gel purify 08/09 02:30
29F：→ mattmatt:最後就会少到无法做後续 08/09 02:30
30F：→ mattmatt:可以PCR多个五六管一起load胶做Gel purification 08/09 02:31
31F：→ mattmatt:elute用35~40左右 然後直接digestion 但ligation可能不 08/09 02:32
32F：→ match308:=>digestion=>gel purify=>ligation,我没做过切完後不纯 08/09 02:33
33F：→ mattmatt:适合RE的酵素 还是纯化比较好 (但量又会更少 囧) 08/09 02:33
34F：→ match308:化的,可能可行但至少要heat inactivate吧 08/09 02:34
35F：→ honeytea96:回mattmatt大 我是P Ecoli K12的genomic DNA没错 08/09 09:20
36F：→ honeytea96:量是加4ul(浓度50ng/ul) cycle数是40 所以还是量太少 08/09 09:22
37F：→ honeytea96:吗@@ 总之我会照mattmatt大&match308大的建议去做做看 08/09 09:23
38F：→ honeytea96:的!!! 谢谢大家的回应~!! 08/09 09:23
39F：→ tsubasawolfy:不能改善PCR的条件增加产量看看吗@@? 08/09 10:26
40F：→ honeytea96:大概已经作了十次以上的PCR 这个大概是最好的条件了@@ 08/09 22:14
41F：推 huhu126:PCR的效率确实不好,但gel purification的效果也不好.... 08/09 22:26
42F：→ huhu126:可以试着提高gel浓度,跑开一点再切胶吗?我觉得问题不在於 08/09 22:29
43F：→ huhu126:PCR产量(如前几位所言,用个4,5管也就够了),问题在於纯化不 08/09 22:30
44F：推 huhu126:纯化效果差,可以loading 60ul PCR product,纯化时加25ul 08/09 22:35
45F：→ huhu126:ddH2O之类的,或是换个kit纯化(要个试用品,看哪个合适也行) 08/09 22:37