作者boblu (六百)
看板Biotech
標題[求救] Vector only 的 control 比 vector + insert 長得還多？
時間Fri Aug 6 22:34:08 2010
囧 cloning 真的不是我的強項 囧
手上有一個片段 (8xx bp) 已經以 TA cloning 放到 vector 裡面
要轉到另外一個 expression vector (pCS2+, 兩生類與魚類用的, 3xxx bp）
TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆為唯一）夾在中間
expression vector 上的 MCS 當然也是有這兩個 site
pCS2+ 跟 TA construct 同時作 double digest 以後
pCS2+ CIP 一小時（double digest 應該沒必要 CIP？想說有作有安心）
在 gel 上有看到 insert 被 release 出來
--> pCS2+ 的 double digest 應該也是成功的吧？
gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫爾比大約3:1）作 ligation
control 就是用水代替 insert
用的是 Takara 的 kit 2.1
O/N 以後取一半的 ligation product 丟 Invitrogen 的 competent cell
結果：
vector only 的那一組長得比有 insert 的還多 囧
這種事發生不只一次了 實在已經想不出還漏了什麼？
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 131.212.202.90
1F：→ relaxsleep:有沒有接上才是重點吧@@ 08/07 00:43
2F：→ senlin:1.兩者都有star activity 2.買新的CIP 3.換成SAP 08/07 01:20
1. NEB 書上的說法是說在我用的反應條件下不會有可偵測的 star activity
切完跑 gel 看起來也是沒有明顯的 star activity
又而且 vector only 也是用 double digest 過的啊
3F：→ soom:會不會是competent cell的問題？(機率很低啦我知道) 08/07 01:28
用過兩批批號不同的 comptetent cell 加上自製的
4F：→ boblu:長得比 control 少 根據過去的經驗有接上的機率低過百分之一 08/07 02:25
5F：→ boblu:另外這個 vector 沒辦法作藍白篩選 08/07 02:25
有沒有可能只是作 gel extraction 切膠的時候還是帶到了 circular form 的 vector
因為跑膠的時候 band shift 的幅度沒有很大
只是這樣可以解是 vector only 為什麼長很多 卻無法解釋為什麼加了 inser 會變少啊？
（影響 circular form 被吃進去的比例？）
※ 編輯: boblu 來自: 131.212.202.90 (08/07 03:34)
6F：→ boblu:修了文 推一下 請各位闆友再進來指導 08/07 03:35
7F：推 mattmatt:請問double digest時間多久? 以及plasmid和RE的量? 08/07 04:21
37C 四個半小時, pCS2+ 用了 4ug, RE各1uL
8F：→ mattmatt:ligation的溫度? 08/07 04:24
16C O/N
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 05:30)
9F：→ tsubasawolfy:takara那組不是建議做bluntend才ON? 一般sticky 30 08/07 09:11
10F：→ tsubasawolfy:min就可以長一堆 不過ligation再怎樣接不上去 08/07 09:12
11F：→ tsubasawolfy:I+V那組應該也要長得跟V only一樣多.. 08/07 09:13
12F：→ tsubasawolfy:而且TA剪下來貼上新的這成功率跟羊入虎口沒兩樣.. 08/07 09:15
13F：→ tsubasawolfy:兩者做gel extraction後的品質呢?例如nanodrop顯示的 08/07 09:18
14F：→ tsubasawolfy:全波長讀值曲線有沒有鹽類太高 酒精沒甩乾淨 08/07 09:19
這方面應該是沒有問題
Wash 以後都有照 protocol 甩兩次
nanodrop 看起來也還算正常（不過我不太知道到什麼程度才算是太？）
最後的 elute buffer 裡面有 tris,
不過 Takara 的 kit 說明書裡面說那個 kit 喜歡 tris...
15F：推 liuse:這情況我還蠻常遇到的 CIP不是每次都很好 08/07 09:57
16F：→ liuse:但只要ligation有長的 多挑一點就會挑到 所以建議原PO 08/07 09:57
17F：→ liuse:就直接挑來check了吧 08/07 09:58
請問你的經驗多挑是要挑多少？
我這個 construct 已經好幾次挑三十個都沒有東西的
過去的習慣都是十個挑不到就認為沒有成功了...
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 13:42)
18F：推 icome:你該不會兩個搞反了吧? 08/07 14:41
?
19F：推 mattmatt:4ug 1uL RE切4小時有點不太夠..會有不完全切完的可能.. 08/07 17:59
20F：→ mattmatt:減少plasmid的量&增加切的時間再試試看吧...切ON試試? 08/07 18:01
21F：推 tsubasawolfy:BamHI切ON要看廠牌XD EcoRI倒是沒差 最後ligation 08/07 19:19
22F：→ tsubasawolfy:也用不到那麼多的DNA 減量應該行的通' 08/07 19:20
我沒有 O/N 是怕 star activity
而且同時切了 TA construct, 裡面的 insert 有 release 出來
當然 可能有 gel 看不出來的沒切完全的部分
而且我 gel extraction 的時候, double digest 的 vector 的 band shift 沒有很大
所以還是有 切膠的時候就沾到沒切的 vector 這種狀況的可能吧
下次試試 O/N 然後把膠跑開一點再切看吧
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 23:05)
23F：推 afunafun:可以將ligation產物再用ClaI切30~60分鐘 08/07 23:53
24F：→ afunafun:不過要先確認你的insert有無ClaI切點 08/07 23:53
25F：→ afunafun:在pCS2上的BamHI及EcoRI兩切點中間剛好有ClaI site 08/07 23:56
26F：→ afunafun:可以將沒切乾淨vector給切除 這樣可不用重做 08/07 23:59
可惜剛剛好就是有 ClaI site :(
但是應該可以直接合成 oligo 把 pCS2+ 裡面的 ClaI site 置換掉？
不過我沒有這樣做過
在哪些步驟需要額外的製換 buffer / 去鹽 / 濃縮嗎？
還是 ligation product 直接加 RE 與 buffer 反應時間夠了以後
就可以直接拿去 transform?
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 03:32)
27F：→ boblu:大 E 之後推一下 請大家繼續指教 08/08 03:32
28F：→ match308:如果做法都沒錯的話,建議你換個ligation kit吧,推薦roche 08/08 04:45
29F：推 bluecsky:你挑出來失敗的產物是比較像是self-ligation的嗎? 08/08 07:51
30F：→ bluecsky:如果挑了10個都沒拿到 那可以考慮重做一批試試看 08/08 07:51
31F：→ bluecsky:我覺得可能是enzyme digest跟CIP都沒完全造成的 08/08 07:51
32F：→ bluecsky:你或許可以嘗試一下 讓digest時間拉長 CIP時間1hr夠了 08/08 07:53
33F：→ bluecsky:只怕CIP是失去了活性 不過理論上兩刀應該不cip也沒差 08/08 07:54
34F：→ bluecsky:大多的時候 vector only是可能會長 不過量非常少就是了 08/08 07:56
其實長了不少
所以我猜不是 self ligate 就是一開始就有帶到沒切動的
重做一次的時候會加作 vector only, no ligase 的 control
這樣就算做不出來 也會比較知道哪裡出問題
35F：→ bluecsky:對了 你有分別單獨用兩種enzyme去試者切你的vector嗎? 08/08 07:56
36F：→ bluecsky:說不定有一刀根本沒有 但是你看不出來?? 08/08 07:57
沒有試那個 vector
不過因為作的時候是跟 TA construct side by side 作的
TA construct 要兩刀才會 release 出我要的片段
這一部分確定是有 work 的（但是不知道效率）
應該也可以由此推測 enzyme 跟 buffer 都是好的
除非 vector 續列特別造成不好切？
重作的時候也一起試試看好了 感謝提醒 m<_ _>m
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 09:45)
37F：推 bluecsky:有時候是vector根本就是錯的或是壞的 這也是遇過 08/08 12:42
淦 現在想想還真的有可能
因為那管 pCS2+ 不是我抽的
我也沒有拿去 sequence 過......
hmm 真的至少應該送去把 MCS 部分 sequence 一下...
（RFLP 未必看得出來 因為 pCS 系列好像很多 vector 切出來都會很類似？）
38F：→ bluecsky:另外常見的錯誤有:1.plate抗生素壞了或是濃度錯了 08/08 12:42
39F：→ bluecsky:所以你可以嘗試看看直接塗competent cell上去會不會長 08/08 12:43
這個錯誤事實上出現過 現在應該已經解決
40F：→ bluecsky:或是2.操作的器具有汙染 不過這種colony會很明顯不是 08/08 12:44
這應該不至於
41F：→ bluecsky:基本上這些都遇過 但是不保證真的有發生在你那邊.. 08/08 12:45
謎 謎 謎 囧rz
※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 14:07)
42F：推 veltine:100%這個數字在生物學上行不太通，就好像一開始碰cloning 08/08 16:52
43F：→ veltine:一直以為enzyme在它喜歡的buffer裡，就會有100% activity 08/08 16:54
44F：→ veltine:其實不然，雖然做double digestion但是難保vector同時被 08/08 16:56
45F：→ veltine:兩種enzyme切到；以你的問題為例，說不是你的vector只被切 08/08 16:59
46F：→ veltine:一刀，vector只留一個cutting site，ligation時…insert 08/08 17:00
47F：→ veltine:只有一邊被接上，造成你的vector only的plate長很多… 08/08 17:02
48F：→ veltine:vector+insert的plate長很少，當然這只是推測…Orz 08/08 17:03
49F：→ veltine:建議確認vector上的MCS沒有壞，用EcoRI及另距離一很遠的 08/08 17:06
50F：→ veltine:enzyme切切看，sequencing也是可以確認但有時不怎對...Orz 08/08 17:07
51F：推 bluecsky:找特異性序列或是重新從最初的stock拿來用.. 08/08 18:13
52F：推 tsubasawolfy:公用操作器具污染很好玩..送九千長一堆很高興 08/09 10:25
53F：→ tsubasawolfy:抽出來全部都三千 WTFS 08/09 10:25
54F：推 aceliang:樓上同感...還有人給我分裝competent cell用用過的tip 08/09 13:06
55F：→ aceliang:什麼都不用加，長爽爽 08/09 13:06