囧 cloning 真的不是我的强项 囧 手上有一个片段 (8xx bp) 已经以 TA cloning 放到 vector 里面 要转到另外一个 expression vector (pCS2+, 两生类与鱼类用的, 3xxx bp） TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆为唯一）夹在中间 expression vector 上的 MCS 当然也是有这两个 site pCS2+ 跟 TA construct 同时作 double digest 以後 pCS2+ CIP 一小时（double digest 应该没必要 CIP？想说有作有安心） 在 gel 上有看到 insert 被 release 出来 --> pCS2+ 的 double digest 应该也是成功的吧？ gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫尔比大约3:1）作 ligation control 就是用水代替 insert 用的是 Takara 的 kit 2.1 O/N 以後取一半的 ligation product 丢 Invitrogen 的 competent cell 结果： vector only 的那一组长得比有 insert 的还多 囧 这种事发生不只一次了 实在已经想不出还漏了什麽？ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 131.212.202.90 1. NEB 书上的说法是说在我用的反应条件下不会有可侦测的 star activity 切完跑 gel 看起来也是没有明显的 star activity 又而且 vector only 也是用 double digest 过的啊 用过两批批号不同的 comptetent cell 加上自制的 有没有可能只是作 gel extraction 切胶的时候还是带到了 circular form 的 vector 因为跑胶的时候 band shift 的幅度没有很大 只是这样可以解是 vector only 为什麽长很多 却无法解释为什麽加了 inser 会变少啊？ （影响 circular form 被吃进去的比例？） ※ 编辑: boblu 来自: 131.212.202.90 (08/07 03:34) 37C 四个半小时, pCS2+ 用了 4ug, RE各1uL 16C O/N ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/07 05:30) 这方面应该是没有问题 Wash 以後都有照 protocol 甩两次 nanodrop 看起来也还算正常（不过我不太知道到什麽程度才算是太？） 最後的 elute buffer 里面有 tris, 不过 Takara 的 kit 说明书里面说那个 kit 喜欢 tris... 请问你的经验多挑是要挑多少？ 我这个 construct 已经好几次挑三十个都没有东西的 过去的习惯都是十个挑不到就认为没有成功了... ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/07 13:42) ? 我没有 O/N 是怕 star activity 而且同时切了 TA construct, 里面的 insert 有 release 出来 当然 可能有 gel 看不出来的没切完全的部分 而且我 gel extraction 的时候, double digest 的 vector 的 band shift 没有很大 所以还是有 切胶的时候就沾到没切的 vector 这种状况的可能吧 下次试试 O/N 然後把胶跑开一点再切看吧 ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/07 23:05) 可惜刚刚好就是有 ClaI site :( 但是应该可以直接合成 oligo 把 pCS2+ 里面的 ClaI site 置换掉？ 不过我没有这样做过 在哪些步骤需要额外的制换 buffer / 去盐 / 浓缩吗？ 还是 ligation product 直接加 RE 与 buffer 反应时间够了以後 就可以直接拿去 transform? ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/08 03:32) 其实长了不少 所以我猜不是 self ligate 就是一开始就有带到没切动的 重做一次的时候会加作 vector only, no ligase 的 control 这样就算做不出来 也会比较知道哪里出问题 没有试那个 vector 不过因为作的时候是跟 TA construct side by side 作的 TA construct 要两刀才会 release 出我要的片段 这一部分确定是有 work 的（但是不知道效率） 应该也可以由此推测 enzyme 跟 buffer 都是好的 除非 vector 续列特别造成不好切？ 重作的时候也一起试试看好了 感谢提醒 m<_ _>m ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/08 09:45) 淦 现在想想还真的有可能 因为那管 pCS2+ 不是我抽的 我也没有拿去 sequence 过...... hmm 真的至少应该送去把 MCS 部分 sequence 一下... （RFLP 未必看得出来 因为 pCS 系列好像很多 vector 切出来都会很类似？） 这个错误事实上出现过 现在应该已经解决 这应该不至於 谜 谜 谜 囧rz ※ 编辑: boblu 来自: 71.10.75.57 (08/08 14:07)