作者peowen (只差一件睡袋,我就)
看板Biotech
標題[求救] plasmid construct雙切鑑定對,但是定序不對
時間Wed Aug 4 12:28:04 2010
我把一段序列X從A plasmid amplify出來,然後接到B plasmid上
A plasmid是我之前已經做好,插入了X與GFP gene的fusion sequence,使用BamHI和EcoRI這
兩個cutting sites
B plasmid則是vector本身帶有GFP gene且IRES也和A plasmid不一樣(其他部分皆相同).使
用BspEI和EcoRI這兩個cuttinf sites
(BspEI和EcoRI是前後相鄰的兩個cutting site)
接進去的X序列大小約1 kb
compentent cell是DH5α,用Amp篩
抽plasmid用BspEI和EcoRI雙切鑑定,有切出1 kb的band
到這裡一切都很順利,結果定序卻................................................
我送5個樣本去定序,有兩個比對結果顯示沒接進去,有三個是根本測不出來,反應失敗(囧)
之後,我分別拿amplify X序列的primer和sequencing primer做PCR
sequencing primer那組有一條1 kb的band
amplify primer那組什麼都沒有 (再囧)
我有想過:
1.換掉BspEI
2.汙染?! 換過水,LB broth/plate,Amp等等
3.實驗室助理是建議我,乾脆就直接抽plasmid做cell transfect,然後上flow看有沒有表達
除此之外,請問還有哪些地方是我可以再做調整的,懇請各位前輩指教,謝謝!
(這個plasmid construct做了快一個月,沒做好我就不能做接續的實驗,現在被卡在這裡都
快瘋了 >""""""""""<)
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◆ From: 118.171.83.221
1F：推 aceliang:有點看不懂，B plasmid切了BspEI跟EcoRI之後會有band 08/04 12:43
2F：推 aceliang:你的sequencing primer跟amplifying primer都夾GFP?? 08/04 12:46
3F：→ peowen:正在做的不夾GPF,是vector本身帶有GPF,因為之前是用fusion 08/04 12:48
4F：→ peowen:protein的方式,但是似乎會影響蛋白的功能,所以才想說直接把 08/04 12:50
5F：→ peowen:序列插進去本身帶有GFP的vector 08/04 12:51
6F：推 aceliang:sqeuncing primer直接夾B plasmid也會有band嘛？ 08/04 12:53
7F：→ peowen:有,但是只有200多bp,primer是設計在cloning site前後各100 08/04 13:00
8F：→ peowen:bp左右的位置 08/04 13:00
9F：推 tsubasawolfy:插進帶有GFP的VECTOR做出來跟FUSION GFP差在哪? 08/04 13:04
10F：→ peowen:前者會做出X蛋白,後者是X-linker-GFP蛋白,至少大小就差了40 08/04 13:08
11F：→ peowen:多kD,空間結構也可能會改變@@" 08/04 13:09
補充一下,序列X是某menbrane protein的ORF
我之前有用過A plasmid做過transfect和infect,在transfect這一步可以看到
fusion protein確實表達在細胞膜(by confocal),但是infected cell卻是在胞內表達GPF,
所以才想說,是不是因為在C'加了一大串東西導致它不到膜上,然後換個本身帶有GFP的
vector @@"
※ 編輯: peowen 來自: 118.171.83.221 (08/04 13:18)
12F：推 aceliang:BspEI會不會切到ORF上面？另外infect?這是viral vector? 08/04 13:38
13F：→ peowen:已經確認過ORF上沒有BspEI和EcoRI,是virus vector 08/04 13:43
14F：→ turtle24:兩個切位相鄰中間有足夠間隔嗎 08/04 13:49
15F：→ peowen:沒有,BspEI是2329,EcoRI是2333......,這會是問題的主因嗎? 08/04 13:56
16F：→ turtle24:有一說是沒有足夠的base酵素很難站上去切 08/04 15:44
17F：推 tsubasawolfy:fusion GFP設計的時候不就要加linker了嗎 08/04 17:35
18F：→ tsubasawolfy:linearized DNA上BspEI有兩個mer EcoRI只要一個mer 08/04 17:38
19F：→ tsubasawolfy:就可有100%效率 08/04 17:38
20F：推 ksn:單切後位置有多1kb左右嗎??amplify PCR是否有positive control 08/04 18:44
21F：→ peowen:沒試過單切,但應該只會把plasmid切成線性,不會有1kb的band 08/05 12:17
22F：→ peowen:;positive control是用A plasmid 08/05 12:18
23F：推 ksn:嗯嗯~因為雙切有出現定序卻失敗，想說是否確實質體大小有改變~ 08/05 16:45