作者peowen (只差一件睡袋,我就)
看板Biotech
标题[求救] plasmid construct双切监定对,但是定序不对
时间Wed Aug 4 12:28:04 2010
我把一段序列X从A plasmid amplify出来,然後接到B plasmid上
A plasmid是我之前已经做好,插入了X与GFP gene的fusion sequence,使用BamHI和EcoRI这
两个cutting sites
B plasmid则是vector本身带有GFP gene且IRES也和A plasmid不一样(其他部分皆相同).使
用BspEI和EcoRI这两个cuttinf sites
(BspEI和EcoRI是前後相邻的两个cutting site)
接进去的X序列大小约1 kb
compentent cell是DH5α,用Amp筛
抽plasmid用BspEI和EcoRI双切监定,有切出1 kb的band
到这里一切都很顺利,结果定序却................................................
我送5个样本去定序,有两个比对结果显示没接进去,有三个是根本测不出来,反应失败(囧)
之後,我分别拿amplify X序列的primer和sequencing primer做PCR
sequencing primer那组有一条1 kb的band
amplify primer那组什麽都没有 (再囧)
我有想过:
1.换掉BspEI
2.污染?! 换过水,LB broth/plate,Amp等等
3.实验室助理是建议我,乾脆就直接抽plasmid做cell transfect,然後上flow看有没有表达
除此之外,请问还有哪些地方是我可以再做调整的,恳请各位前辈指教,谢谢!
(这个plasmid construct做了快一个月,没做好我就不能做接续的实验,现在被卡在这里都
快疯了 >""""""""""<)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.171.83.221
1F：推 aceliang:有点看不懂，B plasmid切了BspEI跟EcoRI之後会有band 08/04 12:43
2F：推 aceliang:你的sequencing primer跟amplifying primer都夹GFP?? 08/04 12:46
3F：→ peowen:正在做的不夹GPF,是vector本身带有GPF,因为之前是用fusion 08/04 12:48
4F：→ peowen:protein的方式,但是似乎会影响蛋白的功能,所以才想说直接把 08/04 12:50
5F：→ peowen:序列插进去本身带有GFP的vector 08/04 12:51
6F：推 aceliang:sqeuncing primer直接夹B plasmid也会有band嘛？ 08/04 12:53
7F：→ peowen:有,但是只有200多bp,primer是设计在cloning site前後各100 08/04 13:00
8F：→ peowen:bp左右的位置 08/04 13:00
9F：推 tsubasawolfy:插进带有GFP的VECTOR做出来跟FUSION GFP差在哪? 08/04 13:04
10F：→ peowen:前者会做出X蛋白,後者是X-linker-GFP蛋白,至少大小就差了40 08/04 13:08
11F：→ peowen:多kD,空间结构也可能会改变@@" 08/04 13:09
补充一下,序列X是某menbrane protein的ORF
我之前有用过A plasmid做过transfect和infect,在transfect这一步可以看到
fusion protein确实表达在细胞膜(by confocal),但是infected cell却是在胞内表达GPF,
所以才想说,是不是因为在C'加了一大串东西导致它不到膜上,然後换个本身带有GFP的
vector @@"
※ 编辑: peowen 来自: 118.171.83.221 (08/04 13:18)
12F：推 aceliang:BspEI会不会切到ORF上面？另外infect?这是viral vector? 08/04 13:38
13F：→ peowen:已经确认过ORF上没有BspEI和EcoRI,是virus vector 08/04 13:43
14F：→ turtle24:两个切位相邻中间有足够间隔吗 08/04 13:49
15F：→ peowen:没有,BspEI是2329,EcoRI是2333......,这会是问题的主因吗? 08/04 13:56
16F：→ turtle24:有一说是没有足够的base酵素很难站上去切 08/04 15:44
17F：推 tsubasawolfy:fusion GFP设计的时候不就要加linker了吗 08/04 17:35
18F：→ tsubasawolfy:linearized DNA上BspEI有两个mer EcoRI只要一个mer 08/04 17:38
19F：→ tsubasawolfy:就可有100%效率 08/04 17:38
20F：推 ksn:单切後位置有多1kb左右吗??amplify PCR是否有positive control 08/04 18:44
21F：→ peowen:没试过单切,但应该只会把plasmid切成线性,不会有1kb的band 08/05 12:17
22F：→ peowen:;positive control是用A plasmid 08/05 12:18
23F：推 ksn:嗯嗯~因为双切有出现定序却失败，想说是否确实质体大小有改变~ 08/05 16:45