作者janemary (珍)
看板Biotech
標題超節省 繼代細胞法
時間Mon Jul 26 17:52:19 2010
剛開始學養細胞時 進階舉辦了一場有關細胞培養的演講
講師是食研所的負責人
他說 食研所負責這麼多種的細胞培養
他們繼代時從不離心 因為離心傷細胞
那這樣子要怎麼passage呢?
我發展了一套超節省超環保的繼代細胞法
過程中只需要用2支無菌dropper 完全不需用到塑膠pipette
但前提是 須將細胞養在10cm dish中 以我的MRC-5 cell為例
1. 一開始解凍細胞時須以37℃快速解凍後，就直接將細胞加入10cm dish中，
medium約10mL，不需離心，隔天等細胞貼上後換medium就好
換medium時直接把上蓋打開把medium倒到廢液桶就好，再用dropper吸約7mL
medium到dish中。
大部分的細胞 (像我的MRC-5) 是不太會受低濃度的DMSO影響的，只有少部分細胞
很敏感才需要以離心把DMSO去掉，例如 MDCK cell。而直接把上蓋打開把medium
倒到這種豪氣的作法是要勇氣的，要一氣呵成 (其實就跟配meduim一樣，大家不
都是把DMEM跟MEM直接倒出來到flask中) 本人從沒有污染過，同事看我這樣也很
傻眼沒人跟進，但是這樣就直接省下了1支塑膠pipette，吸medium時我都是用
dropper，只是要吸很多次而已，除非是在分細胞到很多well中才會用到比較方便
的pipette。成本來說無菌dropper約3元/支，5mL pipette約4.2元/支，
10mL pipette約4.5元/支。
2. 繼代細胞時，一開始也是直接把medium倒掉後，用dropper1吸約2.5~3mL PBS
輕輕滴到細胞上 (此時把dropper1要留著倒放在架子上，不要碰到別的東西就好，
通常我們都用50mL離心管所附的保麗龍)，以PBS wash細胞後直接倒掉，再用
dropper1吸1mL T/E到dish (因為T/E本來就是溶在PBS中，所以不衝突) ，
dropper1一樣要留著，接下來就是放到37℃作用。這一步是關鍵步驟，每個細胞
作用時間不一樣，開始時要test作用時間，要找到細胞要掉不掉的時間，像我
MRC-5作用4min會全掉下來，但作用2.5min時不拍它，它還是暫時不會飄起來，
為什麼要這樣子？因為作用到2.5min時就用dropper1把T/E吸掉 (dropper1要
繼續留著)，此時細胞還在disk上。用dropper2吸約2mL medium到dish中
(dropper2要留著)，再用dropper1 pipetting細胞看要分幾分幾，再用dropper2
補足medium。
整個過程只需用到2支dropper，省下了離心管和無數支pipette，我相信大部分的人
每一個步驟都用掉一支pipette，整個過程下來4~5支pipette外加一支離心管跑不掉，
因為很過程麻煩，大家又怕污染，所以不好推動，給大家參考囉！
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◆ From: 140.112.125.206
1F：推 tsubasawolfy:1.解凍細胞本來就case by case.... 07/26 17:54
2F：→ tsubasawolfy:另外dropper要怎樣定吸多少? 上面又沒刻度 07/26 17:55
3F：→ ordinary07:用倒的 容易邊邊留下液體 到時候污染不就... 07/26 18:03
4F：→ ordinary07:我少量時候都只用tip 更省 - -" 07/26 18:06
5F：→ ordinary07:不過大量的話我也用 dropper 上面有刻度阿:D 最大是3mL 07/26 18:12
6F：→ milkpa:用suction加上玻璃滴管加上酒精不就所有移除medium的動作 07/26 18:20
7F：→ milkpa:都能做..... 07/26 18:20
8F：→ milkpa:其實重點在計算哪些動作可以共用哪些不能，一氣呵成最重要 07/26 18:22
9F：→ tsubasawolfy:同樓上接suction就好 PBS*1 Trypsin*1 Medium*1 07/26 18:22
10F：→ tsubasawolfy:總共3 1000uL tip就可以完成 dropper還可以超音波 07/26 18:22
11F：→ tsubasawolfy:滅菌後烘乾再使用..不過省這沒意思 07/26 18:23
12F：推 yohko86:繼代我連T/E都沒去除 直接用medium稀釋掉 07/26 18:30
13F：→ mzac1b:我也是繼代直接當作血清中和TE 不另外離心 07/26 18:57
14F：推 genewing:反正是老闆出錢...看在被奴役的份上..我都選最浪費的方法 07/26 20:46
15F：推 genewing:省時..不汙染...比省錢更重要... 07/26 20:49
16F：推 celestial318:平常繼代應該不用離心吧 07/27 11:13
17F：推 icome:用倒的邊邊留下液體 用酒精棉擦掉就好了 07/27 13:01
18F：推 icome:另外 用倒的真的很容易污染 我medium分裝都慢慢吸 07/27 13:04
19F：推 conective:不污染比較重要.... 07/27 15:48
20F：→ janemary:其實做法很多都可以 我訴求一向是能省一支tip就是環保囉! 07/27 18:04
21F：→ untilnow:總覺得...有點野人獻曝的味道？ 07/28 21:30
22F：→ Danielle:你可以用玻璃pippet...最環保 07/29 00:13
23F：→ garybounce:玻璃pippet +1 最環保不就用這個嗎? 07/30 22:35
24F：→ mzac1b:在醫院作實驗很多沒有回收使用器材的設備 07/30 23:07
25F：→ xcvbnm:我繼代培養都是一根pippet + 2~3根1000uL Tip 08/04 19:22
26F：→ xcvbnm:除了medium~其他都是用tip吸取~自己認為很省了XD 08/04 19:23
27F：→ xcvbnm:但是Trypsin和PBS都是50ml tube分裝~至少沒污染過 08/04 19:24