作者donnasafin (..)
看板Biotech
標題[求救] 限制酵素double digest
時間Fri Jul 23 13:35:25 2010
請問各位大大
我現在進行一個基因接上GFP vector的construct
限制酵素切位選擇是以BamHI及Bgl II這兩個酵素作選擇
遇到的問題是,
1)37℃作double digest 2小時
2)37℃ 20小時
將載體作CIP的處理
之後再將產物以膠純化作ligation 16℃ overnight
塗plate後 養菌約14hours都沒有長出任何的菌株
想請教是否因為這兩種限制酵素作double digest沒辦法切動
導致ligation的步驟沒辦法完成
謝謝大家~
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◆ From: 140.117.91.9
1F：→ fcku413:之前也是用這兩個怎都黏不起來 = = 切位相同很麻煩 07/23 13:41
2F：→ rimeni:這一組是compatible ends就算切動了也會長得一塌糊塗 07/23 13:47
3F：→ donnasafin:請問長得一蹋糊塗的情況是指什麼情況~目前是菌株都沒長 07/23 15:01
4F：推 micocat:insert應該沒CIP吧...XDD 07/23 16:45
5F：→ micocat:我的經驗是非常好接 但是要挑方向 07/23 16:45
6F：→ fcku413:兩個都CIP會接不起來吧 VECTOR已經CIP了 07/23 16:48
7F：→ donnasafin:只有vector有作CIP~請問大大挑方向的意思是? 07/23 17:01
8F：推 micocat:因為兩端都接得起來 所以會有正接反接的問題 07/23 17:06
9F：→ micocat:你的情況是什麼都沒長 可能的問題太多了 07/23 17:07
10F：→ fcku413:對阿 所以用這組ENZYME真的是自找苦吃 除非不得已 07/23 17:07
11F：推 spirithorse:有時間的話,分別各自切BamH1和BglI再跑膠和mini比較 07/23 19:40
12F：→ spirithorse:如果有切斷的話,就會看到plasmid size會變 07/23 19:41
13F：→ spirithorse:這樣就可以知道是哪一個enzyme沒切斷了~ 07/23 19:41