作者donnasafin (..)
看板Biotech
标题[求救] 限制酵素double digest
时间Fri Jul 23 13:35:25 2010
请问各位大大
我现在进行一个基因接上GFP vector的construct
限制酵素切位选择是以BamHI及Bgl II这两个酵素作选择
遇到的问题是,
1)37℃作double digest 2小时
2)37℃ 20小时
将载体作CIP的处理
之後再将产物以胶纯化作ligation 16℃ overnight
涂plate後 养菌约14hours都没有长出任何的菌株
想请教是否因为这两种限制酵素作double digest没办法切动
导致ligation的步骤没办法完成
谢谢大家~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.117.91.9
1F：→ fcku413:之前也是用这两个怎都黏不起来 = = 切位相同很麻烦 07/23 13:41
2F：→ rimeni:这一组是compatible ends就算切动了也会长得一塌糊涂 07/23 13:47
3F：→ donnasafin:请问长得一蹋糊涂的情况是指什麽情况~目前是菌株都没长 07/23 15:01
4F：推 micocat:insert应该没CIP吧...XDD 07/23 16:45
5F：→ micocat:我的经验是非常好接 但是要挑方向 07/23 16:45
6F：→ fcku413:两个都CIP会接不起来吧 VECTOR已经CIP了 07/23 16:48
7F：→ donnasafin:只有vector有作CIP~请问大大挑方向的意思是? 07/23 17:01
8F：推 micocat:因为两端都接得起来 所以会有正接反接的问题 07/23 17:06
9F：→ micocat:你的情况是什麽都没长 可能的问题太多了 07/23 17:07
10F：→ fcku413:对阿 所以用这组ENZYME真的是自找苦吃 除非不得已 07/23 17:07
11F：推 spirithorse:有时间的话,分别各自切BamH1和BglI再跑胶和mini比较 07/23 19:40
12F：→ spirithorse:如果有切断的话,就会看到plasmid size会变 07/23 19:41
13F：→ spirithorse:这样就可以知道是哪一个enzyme没切断了~ 07/23 19:41