作者relaxsleep (火球連發~)
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標題[求救] His-tag protein 純化問題
時間Fri Jul 16 08:12:56 2010
目前我使用His-BIND Resin來純化我的蛋白質
使用的plasmid為pPICZaC使我的目標蛋白尾巴帶有6xHis
我使用的是約15ml管住(內填充3ml resin約1cm高)
試劑為
8X Binding Buffer(40mM imidazole,4M NaCl,160mM Tris-HCl pH 7.9)
8X Washing Buffer (480mM imidazole, 4M NaCl, 160mM Tris-HCl pH 7.9)
4X Eluting Buffer (4M imidazole, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9)
4X Striping Buffer (400mM EDTA, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9)
8X Charging Buffer (400mM NiSO2)
步驟如下
(1) 使用3ml ddH2O清洗三次
(2) 5 ml之1X Charging Buffer清洗三次
(3) 3 ml之1X Binding Buffer清洗兩次
SAMPLE使用8X Binding Buffer調成1X
純化步驟如下：
(1)將酵素的crude extract加於column上端(有濃縮過約10ML粗抽濃縮成2ML)。
(2)以20 ml之1X Binding Buffer沖洗column。
(3)以18 ml之1X Washing Buffer沖洗column。
(4)以7 ml之1X Eluting Buffer沖洗出結合於resin上之酵素，並收集沖洗出之純化酵素
溶液。
(5)最後以6 ml之1× Striping Buffer清洗column，藉以移除resin上之Ni2＋，並將
column (含1x Striping Buffer)存放於4℃冰箱以備下次純化時使用。
然後使用PBS pH7.4去透析(約500ml體積) O/N移除IMIDAZOLE
接著使用SDS-PAGE分析並沒有看到純化的BAND產生
酵素活性測試發現從crude extract加入column後活性最高
接著binding buffer
washing buffer
eluting buffer都檢測的到活性 且越來越低
這是沒有接上his嗎?
或者是imidazole濃度太高了?
我膠體這次是第二次跑是新的，以前沒跑過，步驟有錯誤嗎麻煩大家指點!
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◆ From: 140.129.35.106
※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (07/16 08:13)
※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (07/16 08:14)
1F：推 liuse:有先小量induction確定有表現嘛? 07/16 09:55
2F：推 tsubasawolfy:他的crude extrzct都有band了...wash 60mM是一般範圍 07/16 10:24
3F：→ tsubasawolfy:不過你的binding buffer就留不住蛋白了 有定序過 07/16 10:24
4F：→ tsubasawolfy:his有in frame? 07/16 10:25
5F：→ relaxsleep:小量有很明顯的一條band 大量表現後雜band就變多了 07/16 10:43
6F：→ relaxsleep:序列到HIS-都是對的是IN FRAME 07/16 11:32
7F：→ Rinehot:有用antiHis確認過有沒有表現嗎? 07/16 16:02
8F：→ relaxsleep:我沒用antihis耶 目前把eluting的都拿去濃縮7ml→0.2ml 07/16 17:04
9F：→ relaxsleep:有看到淡淡的band這是抓到的濃度太低嗎@@? 07/16 17:05
10F：→ Rinehot:你染色的方式是? 07/16 18:55
11F：→ Rinehot:有可能是protein上的his跟Ni結合力太低 07/16 18:56
12F：→ Rinehot:可以試試看加入少量的detergent glycerol 07/16 18:58
13F：推 bluecsky:單用his-tag要抓到很純的蛋白 大概命要很好(遠望) 07/16 19:21
14F：→ relaxsleep:我使用Coomassie Blue R250染色 DETERGENT GLYCEROL加 07/16 23:44
15F：→ relaxsleep:的濃度是?? 在哪步驟加呢? 07/16 23:45
16F：→ relaxsleep:blue大說的好心酸阿XD 07/16 23:45
17F：推 singren:友情推..你有那各命嗎~XD" 07/19 09:17
18F：推 mattmatt:pPICZaC.你應該是使用pichia表現收外泌蛋白吧 07/22 13:10
19F：→ mattmatt:感覺protein結合力太低...可能要檢查一下charging的藥劑 07/22 13:12
20F：→ mattmatt:還有濃縮的步驟蛋白是否lost掉..或沉澱... 07/22 13:12
21F：→ mattmatt:我是用Qiagen的 ni-nta agarose 不必charging 07/22 13:14
22F：→ mattmatt:但步驟建議binding的步驟是使用buffer懸浮agarose 07/22 13:14
23F：→ mattmatt:將agarose與蛋白溶液混合 搖晃2hr~隔夜 抓更多的his- 07/22 13:16
24F：→ mattmatt:可能比直接將蛋白液通colunm抓得更完全吧 07/22 13:17
25F：→ mattmatt:外泌的蛋白比胞內單純的多 得到純的蛋白機會應該是好一點 07/22 13:18
26F：→ mattmatt:可以說明怎麼濃縮嗎? 07/22 13:19
27F：→ relaxsleep:我有懸浮起來binding 濃縮是使用膜離心那裝置 忘了叫啥 07/23 01:34
28F：→ relaxsleep:分子量是10KDA的膜 比他分子量小的會濾過去 水也是 07/23 01:36
29F：推 mattmatt:會不會plasmid序列有錯沒做出his tag阿....? 08/07 04:54