作者relaxsleep (火球连发~)
看板Biotech
标题[求救] His-tag protein 纯化问题
时间Fri Jul 16 08:12:56 2010
目前我使用His-BIND Resin来纯化我的蛋白质
使用的plasmid为pPICZaC使我的目标蛋白尾巴带有6xHis
我使用的是约15ml管住(内填充3ml resin约1cm高)
试剂为
8X Binding Buffer(40mM imidazole,4M NaCl,160mM Tris-HCl pH 7.9)
8X Washing Buffer (480mM imidazole, 4M NaCl, 160mM Tris-HCl pH 7.9)
4X Eluting Buffer (4M imidazole, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9)
4X Striping Buffer (400mM EDTA, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9)
8X Charging Buffer (400mM NiSO2)
步骤如下
(1) 使用3ml ddH2O清洗三次
(2) 5 ml之1X Charging Buffer清洗三次
(3) 3 ml之1X Binding Buffer清洗两次
SAMPLE使用8X Binding Buffer调成1X
纯化步骤如下：
(1)将酵素的crude extract加於column上端(有浓缩过约10ML粗抽浓缩成2ML)。
(2)以20 ml之1X Binding Buffer冲洗column。
(3)以18 ml之1X Washing Buffer冲洗column。
(4)以7 ml之1X Eluting Buffer冲洗出结合於resin上之酵素，并收集冲洗出之纯化酵素
溶液。
(5)最後以6 ml之1× Striping Buffer清洗column，藉以移除resin上之Ni2＋，并将
column (含1x Striping Buffer)存放於4℃冰箱以备下次纯化时使用。
然後使用PBS pH7.4去透析(约500ml体积) O/N移除IMIDAZOLE
接着使用SDS-PAGE分析并没有看到纯化的BAND产生
酵素活性测试发现从crude extract加入column後活性最高
接着binding buffer
washing buffer
eluting buffer都检测的到活性 且越来越低
这是没有接上his吗?
或者是imidazole浓度太高了?
我胶体这次是第二次跑是新的，以前没跑过，步骤有错误吗麻烦大家指点!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
※ 编辑: relaxsleep 来自: 140.129.35.106 (07/16 08:13)
※ 编辑: relaxsleep 来自: 140.129.35.106 (07/16 08:14)
1F：推 liuse:有先小量induction确定有表现嘛? 07/16 09:55
2F：推 tsubasawolfy:他的crude extrzct都有band了...wash 60mM是一般范围 07/16 10:24
3F：→ tsubasawolfy:不过你的binding buffer就留不住蛋白了 有定序过 07/16 10:24
4F：→ tsubasawolfy:his有in frame? 07/16 10:25
5F：→ relaxsleep:小量有很明显的一条band 大量表现後杂band就变多了 07/16 10:43
6F：→ relaxsleep:序列到HIS-都是对的是IN FRAME 07/16 11:32
7F：→ Rinehot:有用antiHis确认过有没有表现吗? 07/16 16:02
8F：→ relaxsleep:我没用antihis耶 目前把eluting的都拿去浓缩7ml→0.2ml 07/16 17:04
9F：→ relaxsleep:有看到淡淡的band这是抓到的浓度太低吗@@? 07/16 17:05
10F：→ Rinehot:你染色的方式是? 07/16 18:55
11F：→ Rinehot:有可能是protein上的his跟Ni结合力太低 07/16 18:56
12F：→ Rinehot:可以试试看加入少量的detergent glycerol 07/16 18:58
13F：推 bluecsky:单用his-tag要抓到很纯的蛋白 大概命要很好(远望) 07/16 19:21
14F：→ relaxsleep:我使用Coomassie Blue R250染色 DETERGENT GLYCEROL加 07/16 23:44
15F：→ relaxsleep:的浓度是?? 在哪步骤加呢? 07/16 23:45
16F：→ relaxsleep:blue大说的好心酸阿XD 07/16 23:45
17F：推 singren:友情推..你有那各命吗~XD" 07/19 09:17
18F：推 mattmatt:pPICZaC.你应该是使用pichia表现收外泌蛋白吧 07/22 13:10
19F：→ mattmatt:感觉protein结合力太低...可能要检查一下charging的药剂 07/22 13:12
20F：→ mattmatt:还有浓缩的步骤蛋白是否lost掉..或沉淀... 07/22 13:12
21F：→ mattmatt:我是用Qiagen的 ni-nta agarose 不必charging 07/22 13:14
22F：→ mattmatt:但步骤建议binding的步骤是使用buffer悬浮agarose 07/22 13:14
23F：→ mattmatt:将agarose与蛋白溶液混合 摇晃2hr~隔夜 抓更多的his- 07/22 13:16
24F：→ mattmatt:可能比直接将蛋白液通colunm抓得更完全吧 07/22 13:17
25F：→ mattmatt:外泌的蛋白比胞内单纯的多 得到纯的蛋白机会应该是好一点 07/22 13:18
26F：→ mattmatt:可以说明怎麽浓缩吗? 07/22 13:19
27F：→ relaxsleep:我有悬浮起来binding 浓缩是使用膜离心那装置 忘了叫啥 07/23 01:34
28F：→ relaxsleep:分子量是10KDA的膜 比他分子量小的会滤过去 水也是 07/23 01:36
29F：推 mattmatt:会不会plasmid序列有错没做出his tag阿....? 08/07 04:54