作者nux7 (坎比)
看板Biotech
標題[求救] 大分子量的蛋白質轉不過去! (350kDa)
時間Thu Jul 1 22:57:28 2010
最近剛嘗試跑大分子量的蛋白質電泳,分子量為350kDa,在transfer部分遇到
大瓶頸, 麻煩板上的大家幫忙一下!!
我的條件是, 濕式轉漬法, 固定電流300mA, 為時兩小時, Transfer buffer:含Glycine&
Tris-base, 20%MeOH
(因為我跑分子量80kDa,條件為300mA/90分鐘,就天真的選用這個條件 囧), 之後
把Gel用Coomassie染色後才發現,根本沒過去...
爬了板上的文, 發現大家似乎有在加入SDS幫助轉漬效率,想請問一下大家的方法與條件!!
另一方面, 在跑gel方面,我是跑6%的gel,條件為 固定電壓130V/150分鐘,因為marker
最大只到170kDa,所以都是憑感覺抓位置的,不知道板上的各位Running的條件也差不多嗎?
還有就是Running完,buffer都燙燙的,這樣可以嗎?
謝謝大家了!!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.97.10
1F：推 a001ou:MeOH會影響大分子量的蛋白轉漬 建議可以不要加 07/02 17:07
2F：→ leoblack:減少你的MeOH(MeOH幫助fix),增加你的SDS(SDS幫助游離) 07/02 19:37
3F：→ leoblack:另外請整個抱去冷房裡面跑~底部加著stir轉轉幫助對流散熱 07/02 19:38
4F：推 a001ou:推樓上 07/02 20:30
5F：推 loham:400mA,2.5hr 250kDa可以,如果不想換buffer 試試看時間拉長 07/02 22:37
6F：推 loham:對了,是埋在冰裡或加冰包transfer 07/02 22:39
7F：→ nux7:請問一下,MeOH2的減少與加入SDS的配方建議是? 謝謝!!^^ 07/03 03:26
8F：→ nux7:還有假如調整了buffer的配方,電壓的參數是否也應該有所調整呢 07/03 03:27
9F：→ nux7:網上的資訊是加入0.05%的SDS,但似乎沒有改變MeOH的比例,不知 07/03 03:39
10F：→ nux7:這樣的條件是否得宜? 謝謝各位了!!! 07/03 03:41
11F：推 bigcat24:MeOH 10% SDS 0.05% 400mA 2.5hr try it :) 07/03 23:24