作者ballycotton7 (昂 布拉股)
看板Biotech
標題[討論] 抽膜蛋白
時間Tue Jun 29 20:28:33 2010
最近老闆想要看蛋白translocate到膜上
他給我的方法是
用含有protease inhinitor的 1mM Tris作為低張溶液將細胞刮下
Vortex後 作用5分鐘 脹破細胞
離心5000rpm 5分鐘 收集上清液
pellet再用1mM Tris Vortex後作用5分鐘
重複 作用=>離心 步驟三次
三次的上清液去超高速離心45000rpm 75min
離下來的pellet為membrane fraction 上清液為Cytsol
收下來的membrane目前看起來是沒問題
可是cytosol protein定量出來超低
Western跑出來目標的protein也完全沒有訊號
目前懷疑可能原因是細胞並沒有脹破的完全
請問版友們有沒有甚麼這方面的經驗可以提供改進
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.49.21
1F：→ turtle24:上清液體積太多? 細胞太少? 06/29 21:11
2F：→ ballycotton7:不會耶 我以前用過同樣體積的lysis buffer收起來是沒 06/29 22:23
3F：→ ballycotton7:問題的 06/29 22:23
4F：推 silverberry:如果有預算 Thermo 的 Mem-PER Eukaryotic Membrane 06/29 22:48
5F：→ silverberry:Protein Extraction Kit 可以考慮一下 06/29 22:48
7F：推 liuse:用一組貴貴的douncer來弄破細胞膜 再用顯微鏡看 06/30 08:08
8F：→ ballycotton7:對阿 有人建議我用douncer 可是不知道那一根要多少 06/30 13:49
9F：→ ballycotton7:現在再想如果用30號針頭收吸把細胞弄破會不會好點? 06/30 13:50
10F：推 vandia:你的離心速度換算成g是多少? 太低是離不開的 06/30 19:47
11F：→ ballycotton7:剛算了下應該是72000g左右 07/01 01:16
12F：→ ballycotton7:我用離下來的pellet去跑是有東西的 但是就是cytosol 07/01 01:17
13F：→ ballycotton7:的protein量超低 我覺得這點比較詭異 07/01 01:18
14F：→ vandia:我手邊的paper離膜蛋白都至少上到10g喔,給你參考 07/02 00:28
15F：→ vandia:10萬g... 07/02 00:29