作者ballycotton7 (昂 布拉股)
看板Biotech
标题[讨论] 抽膜蛋白
时间Tue Jun 29 20:28:33 2010
最近老板想要看蛋白translocate到膜上
他给我的方法是
用含有protease inhinitor的 1mM Tris作为低张溶液将细胞刮下
Vortex後 作用5分钟 胀破细胞
离心5000rpm 5分钟 收集上清液
pellet再用1mM Tris Vortex後作用5分钟
重复 作用=>离心 步骤三次
三次的上清液去超高速离心45000rpm 75min
离下来的pellet为membrane fraction 上清液为Cytsol
收下来的membrane目前看起来是没问题
可是cytosol protein定量出来超低
Western跑出来目标的protein也完全没有讯号
目前怀疑可能原因是细胞并没有胀破的完全
请问版友们有没有甚麽这方面的经验可以提供改进
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.49.21
1F：→ turtle24:上清液体积太多? 细胞太少? 06/29 21:11
2F：→ ballycotton7:不会耶 我以前用过同样体积的lysis buffer收起来是没 06/29 22:23
3F：→ ballycotton7:问题的 06/29 22:23
4F：推 silverberry:如果有预算 Thermo 的 Mem-PER Eukaryotic Membrane 06/29 22:48
5F：→ silverberry:Protein Extraction Kit 可以考虑一下 06/29 22:48
7F：推 liuse:用一组贵贵的douncer来弄破细胞膜 再用显微镜看 06/30 08:08
8F：→ ballycotton7:对阿 有人建议我用douncer 可是不知道那一根要多少 06/30 13:49
9F：→ ballycotton7:现在再想如果用30号针头收吸把细胞弄破会不会好点? 06/30 13:50
10F：推 vandia:你的离心速度换算成g是多少? 太低是离不开的 06/30 19:47
11F：→ ballycotton7:刚算了下应该是72000g左右 07/01 01:16
12F：→ ballycotton7:我用离下来的pellet去跑是有东西的 但是就是cytosol 07/01 01:17
13F：→ ballycotton7:的protein量超低 我觉得这点比较诡异 07/01 01:18
14F：→ vandia:我手边的paper离膜蛋白都至少上到10g喔,给你参考 07/02 00:28
15F：→ vandia:10万g... 07/02 00:29