作者linsnow (你還是省省吧)
看板Biotech
標題[求救] 想請問關於transfer大分子量protein
時間Sun Jun 20 01:01:43 2010
我所要偵測的是TrkA (約140 kDa)這個在細胞膜上的receptor磷酸化的程度
但發現無論在怎麼樣都無法偵測到，連未磷酸化的TrkA也無法偵測
後來染膠的時後發現大分子量(>100 kDa)的部分似乎transfer的效果都不好
判斷似乎是因為這樣導致無法偵測到其protein的表現
在調整過各種條件仍無法解決
想請問是否有其他改善transfer效率的方法
或是有沒有人也有做TrkA這個蛋白的表現，想請問是怎麼做出來的?
另外，我們家所使用的是invitrogen的XCell II Blot Module
但我也試過semi-dry的方式，依然無法解決
拜託大家了，謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.42.220.47
1F：推 mtdas:try 拉長transfer時間 buffer提高SDS/降低MeOH 06/20 01:43
2F：→ mtdas:membrane protein在lysis時 try提高Tx-100或做direct lysate 06/20 01:43
3F：推 tsubasawolfy:XCell如果你有照他配方正確配buffer 電壓電流時間 06/20 06:48
4F：→ tsubasawolfy:都夠 理論上連350kD的都可以過去XDD 06/20 06:49
5F：推 bluecsky:140KD感覺並不算很大阿 把時間拉長一點 還有你buffer是? 06/20 09:44
6F：→ bluecsky:個人操作的protein常常都是200kD+的 WB還沒什麼大問題 06/20 09:44
7F：推 leoblack:大分子就別試semin-dry了,用wet效率會比較好 06/20 09:50
8F：推 icome:我是用濕式 Towbin's Transfer Buffer; 300mA; 3hr 06/20 16:26
9F：→ icome:180kDa左右都很清楚 06/20 16:27
10F：推 a001ou:140kD不算大 應該不是轉漬不過去的問題而是其他的問題 06/20 18:52
11F：→ humwang:fibronectin >230KDa都沒問題了，建議用濕式transfer 06/29 20:09