作者syming (吸鳴)
看板Biotech
標題[求救] ligation後
時間Fri Jun 18 00:56:55 2010
各位先進 小弟我有事請教
之前我在做ligation 雖然失敗率很大(失敗率超大 感覺有點在拼運氣= =)
但是最後在培養皿上面 有長出一個菌落
之後 我就用tip挖一點點 在有抗生素的LB大量培養
接著就抽plasmid
我當時跑電泳 只有跑vecter跟ligation後的plasmid
發現這兩條column的band約差了insert的長度
所以我當下就覺得ligation應該有成功
但是我現在想說 用酵素切plasmid應該可以得到vector 與 insert的band
但是不知道味啥 跑電泳 那條cloumn卻是空白
之後 像說用PCR 夾出insert 再跑電泳確認
情況也是一樣 跑出電泳膠片 也是什麼都沒有
連作為模板的plasmid也不見了
現在一整個不知道我那ligation後的plasmid是什麼東西
只知道那plasmid的長度與預期的很像
所以想要請問 各位先進 我這是遇到什麼樣的問題?!
謝謝
--
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◆ From: 124.8.2.73
1F：推 Fourfish:跑電泳的vector跟cloned plasmid有切一刀再跑嗎? 06/18 01:01
2F：→ Fourfish:沒有的話這樣比不準喔 06/18 01:02
3F：→ syming:可是現在遇到的狀況 是連切兩刀後的產物都不見了@.@" 06/18 01:06
4F：→ turtle24:多少DNA下去切?多少U酵素?切多久?總體積?跑膠體積? 06/18 01:06
5F：→ syming:樓上說的這些會影響嗎? 大量DNA 反應2hr 電泳膠20ml 06/18 01:11
6F：→ syming:DNA:酵素1:酵素2:buffer:H2O = 5:1:1:1:2 06/18 01:12
7F：→ syming:loading sample的量5uL 06/18 01:13
8F：→ turtle24:有些酵素甘油太多會亂切 06/18 01:57
9F：推 bluecsky:太多了 一般酵素來說 只能佔總體積10% 你這明顯20%了 06/18 03:39
10F：→ bluecsky:請改成5:0.5:0.5:1:3 或是你可以拉大體積改loading量 06/18 03:39
11F：→ bluecsky:一般RE 酵素 0.5ul所帶的U數絕對可以完全切光一般mini 06/18 03:40
12F：→ bluecsky:prep出來約5ul體積中的DNA(假設你mini是回溶50or100ul) 06/18 03:41
13F：→ syming:可是不解的是 我PCR的那條column也都是一條空白 06/18 10:47
14F：→ syming:連template的band 也都看不見… 06/18 10:49
15F：推 Fourfish:我的意思是可能根本沒insert是你被supercoil耍了 所以才 06/18 10:57
16F：→ Fourfish:要問你有沒有切一刀看看是不是真的plasmid有比vector大 06/18 10:58
17F：→ Fourfish:這跟切兩刀意思不一樣(特別是你又執著說它有的情況下...) 06/18 10:59
18F：推 bluecsky:切一刀是比較準 但是也要看你insert有多大吧 06/18 11:16
19F：→ turtle24:PCR的template量跑膠看不到正常吧 加那麼多幹嘛? 06/18 11:17
20F：→ bluecsky:要是你insert有1k以上 vector也沒有特別巨大 06/18 11:17
21F：→ bluecsky:那光是看supercoil大概就分得出來 06/18 11:17
22F：→ bluecsky:PCR template一般加入的量是不會看得出來 不過如果是指 06/18 11:18
23F：→ bluecsky:單純的template 就要看你template load到gel的量有多少.. 06/18 11:18
24F：→ syming:嗯嗯 我剛剛就去切一刀看看 是不是真的被耍了= = 06/18 11:37
25F：→ syming:我的insert≒1.5k 現在就看是不是supercoil耍了我 Q_Q 06/18 11:39
26F：推 tsubasawolfy:沒切的DNA跑膠沒意義.. 06/18 12:14
27F：推 icome:新手難免 在練練吧 運氣很重要 基本技術也很要緊 06/18 16:20
28F：推 bluecsky:沒切的跑膠並不會沒意義阿 看你vector多大 insert多大 06/18 16:48
29F：→ bluecsky:例如3k->4.5k 在0.6% gel下其實supercoil就可以分的出來 06/18 16:49
30F：→ bluecsky:但是要是3k->3.5k 或是9k->12k之類 這就很難分了 06/18 16:49
31F：→ bluecsky:單純看大小差異跟你跑得gel能給的解析度有關 06/18 16:50
32F：→ bluecsky:supercoil是會讓他泳動速度變快 但是大的supercoil 06/18 16:51
33F：→ bluecsky:泳動還是比小的supercoil慢 06/18 16:51
34F：推 bluecsky:當然 這只是單純看band shift看有沒有變化而已 06/18 16:54
35F：→ bluecsky:最準的還是要做RE digest來看 最好可以找出insert特有 06/18 16:54
36F：→ bluecsky:的RE site來搭配 這樣最好 06/18 16:55
37F：推 tsubasawolfy:有shift不能代表接進去是正確的insert 所以才說沒意 06/18 19:02
38F：推 owl628:同意樓上,沒切跑膠真的沒意義 06/18 22:03
39F：推 Fourfish:B大也沒說錯 這樣直接比的確比較方便 不過當電泳有問題時 06/19 00:49
40F：→ Fourfish:該一步步檢查 當遇過同一plasmid抽出後跑出不同位置時 就 06/19 00:53
41F：→ Fourfish:會知道這樣沒比較快..我還遇過有insert的跑出來還比vecto 06/19 00:55
42F：→ Fourfish:r小的咧...size也不過就大概5k->6k 06/19 00:56
43F：→ Fourfish:不過我之前沒注意到的是原PO說跑完膠沒任何band 這比較奇 06/19 00:59
44F：推 conective:個人意見直接重作 而且要檢討ligation的實驗條件與步驟 06/19 02:03
45F：→ conective:只有一顆可挑 切出來又沒東西 成功機率已經不高了 06/19 02:04
46F：→ conective:建議原PO把construct的設計描述一下 請板上先進幫忙看 06/19 02:05
47F：→ conective:有時候作cloning檢討不出原因時 直接往前面的步驟重作 06/19 02:06
48F：→ conective:會比較快點 06/19 02:06
49F：→ turtle24:有些地方DNA定量之後比較方便找失敗的原因 只是麻煩一些 06/19 10:35
50F：→ syming:嗯嗯 謝謝各位的意見 目前 我選擇重做 PCR→切→ligation 06/19 19:16
目前我的作法是
insert≒ 1.5 kb
vector≒ 5.4 kb
(1) PCR
1. 95度 2min
2. 95度 30sec ←－
3. 55度 30sec | 25 cycles
4. 68度 3min30sec －－
5. 68度 15min
6. 4度
(2) digestion
PCR產物 跟vector用 EcoR1與HindIII 切一個小時
digestion condition
DNA(vector) = 6 uL / DNA(insert) = 10 uL
10X buffer = 2 uL
EcoR1 = 1 uL
HindIII = 1 uL
DI H2O = 10 uL / DI H2O = 6 uL
reaction for 37度 1hr
(3)
purification kit 純化digestiont產物
電泳 確定有欲得的產物 (目前做到這幕都是OK的)
(4) ligation (目前無法完全掌握的一步)
insert = 4 uL
vector = 4 uL
ligase = 1 uL
10X buffer = 1 uL
(insert 從膠片上看起來濃於 vector，還是我需要把濃度給訂出來比較好?
再以insert:vector = 5:1 or 3:1 去做ligation )
reaction condition (有三種條件)
1. 4度 overnight
2. 16度 overmight
3. 室溫 1hr
transform to competent cell
不知各位先進 小弟有啥需 要改善的地方
謝謝
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (06/19 19:43)
51F：推 conective:純化之後的insert和vector濃度可以測一下 06/19 22:33
52F：→ conective:提高insert/vector比 16度C overnight試試 06/19 22:35
53F：推 yaliu:感覺你是ligation到轉型那邊有問題～首先請問一下你primer 06/20 00:28
54F：→ yaliu:切位有無留幾個mer??如果沒有留直接切的話應該切不動喔 06/20 00:28
primer的設計 我有考慮到切位要多留幾個mer的問題
所以我在切位前面
有多設計8個mer 用GGG CCC GG
這樣primer的設計應該沒啥太大的問題吧?
55F：→ yaliu:ligation喔～我好像都沒在管比例的～我都insert弄爆多 06/20 00:30
56F：→ yaliu:因為vector感覺比較好得到，我會insert 7, vector 1吧 06/20 00:31
57F：→ yaliu:然後如果確定轉型那邊沒問題，但就是ligation有問題 06/20 00:32
58F：→ yaliu:看看ligation buffer有沒有問題，因為buffer的ATP如果沒有 06/20 00:33
59F：→ yaliu:保存好很容易就壞掉之類的～給你參考囉 06/20 00:33
60F：推 bluecsky:跟樓上一樣 我vector都只拿1 insert都塞到爆 4度C o/n 06/20 09:49
61F：→ bluecsky:ligation buffer看要不要在拿一個新的 確實滿容易壞的 06/20 09:49
62F：→ bluecsky:畢竟有些人操作習慣不太好 buffer拿了用完也不馬上冰好 06/20 09:50
63F：→ bluecsky:讓他一直放在室溫 好一點的飄在融化的冰水中... 06/20 09:50
64F：→ bluecsky:這樣久了以後buffer很容易壞掉 06/20 09:51
我曾經有考慮過是不是ligation buffer ATP降解的問題
(因為中間 有搬過一次家)
所以我目前用新的 ligase與ligation buffer
可是都還沒有成功 懊惱啊~~
所以想說請教板上的先進 我是不是作法有問題?!
像我ligation buffer 是在冰上回溶 ATP應該不會太快裂解吧?
用完也馬上冰回20度 冰箱保存
真的感謝版上的先進 能跟小弟我討論 謝謝
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (06/20 17:26)
65F：→ mtdas:我習慣買來就立即分裝buffer 避免反覆解凍結凍 06/20 20:26
66F：→ mtdas:切位留8mer對EcoRI和HindIII很夠了 R1我習慣留1mer H3留5mer 06/20 20:31
67F：推 yaliu:你elution是用buffer還是用水？用buffer可能效果會較差 06/21 08:18
68F：→ yaliu:再來可以確認一下轉型有無問題～隨便拿個質體試一下 06/21 08:19
69F：→ syming:嗯嗯 我是用buffer 之前有用過水 但是結果也一樣 06/21 12:10
70F：→ syming:所以目前 在檢查是不是competent cell沒做好的問題~ 06/21 12:12
71F：→ jimmykiki:聽起來像是ligation問題 insert放太多有可能兩條自己就 06/24 10:08
72F：→ jimmykiki:黏回去了 你要不要把你看比例的膠圖show出來看看 06/24 10:12
73F：→ jimmykiki:會長那麼少 大部分ligation問題是主因 06/24 10:16
74F：→ syming:兩條黏回去?? 是說 兩條insert黏在一起?會有這情形發生?? 06/24 12:41