作者syming (吸鸣)
看板Biotech
标题[求救] ligation後
时间Fri Jun 18 00:56:55 2010
各位先进 小弟我有事请教
之前我在做ligation 虽然失败率很大(失败率超大 感觉有点在拼运气= =)
但是最後在培养皿上面 有长出一个菌落
之後 我就用tip挖一点点 在有抗生素的LB大量培养
接着就抽plasmid
我当时跑电泳 只有跑vecter跟ligation後的plasmid
发现这两条column的band约差了insert的长度
所以我当下就觉得ligation应该有成功
但是我现在想说 用酵素切plasmid应该可以得到vector 与 insert的band
但是不知道味啥 跑电泳 那条cloumn却是空白
之後 像说用PCR 夹出insert 再跑电泳确认
情况也是一样 跑出电泳胶片 也是什麽都没有
连作为模板的plasmid也不见了
现在一整个不知道我那ligation後的plasmid是什麽东西
只知道那plasmid的长度与预期的很像
所以想要请问 各位先进 我这是遇到什麽样的问题?!
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.8.2.73
1F：推 Fourfish:跑电泳的vector跟cloned plasmid有切一刀再跑吗? 06/18 01:01
2F：→ Fourfish:没有的话这样比不准喔 06/18 01:02
3F：→ syming:可是现在遇到的状况 是连切两刀後的产物都不见了@.@" 06/18 01:06
4F：→ turtle24:多少DNA下去切?多少U酵素?切多久?总体积?跑胶体积? 06/18 01:06
5F：→ syming:楼上说的这些会影响吗? 大量DNA 反应2hr 电泳胶20ml 06/18 01:11
6F：→ syming:DNA:酵素1:酵素2:buffer:H2O = 5:1:1:1:2 06/18 01:12
7F：→ syming:loading sample的量5uL 06/18 01:13
8F：→ turtle24:有些酵素甘油太多会乱切 06/18 01:57
9F：推 bluecsky:太多了 一般酵素来说 只能占总体积10% 你这明显20%了 06/18 03:39
10F：→ bluecsky:请改成5:0.5:0.5:1:3 或是你可以拉大体积改loading量 06/18 03:39
11F：→ bluecsky:一般RE 酵素 0.5ul所带的U数绝对可以完全切光一般mini 06/18 03:40
12F：→ bluecsky:prep出来约5ul体积中的DNA(假设你mini是回溶50or100ul) 06/18 03:41
13F：→ syming:可是不解的是 我PCR的那条column也都是一条空白 06/18 10:47
14F：→ syming:连template的band 也都看不见… 06/18 10:49
15F：推 Fourfish:我的意思是可能根本没insert是你被supercoil耍了 所以才 06/18 10:57
16F：→ Fourfish:要问你有没有切一刀看看是不是真的plasmid有比vector大 06/18 10:58
17F：→ Fourfish:这跟切两刀意思不一样(特别是你又执着说它有的情况下...) 06/18 10:59
18F：推 bluecsky:切一刀是比较准 但是也要看你insert有多大吧 06/18 11:16
19F：→ turtle24:PCR的template量跑胶看不到正常吧 加那麽多干嘛? 06/18 11:17
20F：→ bluecsky:要是你insert有1k以上 vector也没有特别巨大 06/18 11:17
21F：→ bluecsky:那光是看supercoil大概就分得出来 06/18 11:17
22F：→ bluecsky:PCR template一般加入的量是不会看得出来 不过如果是指 06/18 11:18
23F：→ bluecsky:单纯的template 就要看你template load到gel的量有多少.. 06/18 11:18
24F：→ syming:嗯嗯 我刚刚就去切一刀看看 是不是真的被耍了= = 06/18 11:37
25F：→ syming:我的insert≒1.5k 现在就看是不是supercoil耍了我 Q_Q 06/18 11:39
26F：推 tsubasawolfy:没切的DNA跑胶没意义.. 06/18 12:14
27F：推 icome:新手难免 在练练吧 运气很重要 基本技术也很要紧 06/18 16:20
28F：推 bluecsky:没切的跑胶并不会没意义阿 看你vector多大 insert多大 06/18 16:48
29F：→ bluecsky:例如3k->4.5k 在0.6% gel下其实supercoil就可以分的出来 06/18 16:49
30F：→ bluecsky:但是要是3k->3.5k 或是9k->12k之类 这就很难分了 06/18 16:49
31F：→ bluecsky:单纯看大小差异跟你跑得gel能给的解析度有关 06/18 16:50
32F：→ bluecsky:supercoil是会让他泳动速度变快 但是大的supercoil 06/18 16:51
33F：→ bluecsky:泳动还是比小的supercoil慢 06/18 16:51
34F：推 bluecsky:当然 这只是单纯看band shift看有没有变化而已 06/18 16:54
35F：→ bluecsky:最准的还是要做RE digest来看 最好可以找出insert特有 06/18 16:54
36F：→ bluecsky:的RE site来搭配 这样最好 06/18 16:55
37F：推 tsubasawolfy:有shift不能代表接进去是正确的insert 所以才说没意 06/18 19:02
38F：推 owl628:同意楼上,没切跑胶真的没意义 06/18 22:03
39F：推 Fourfish:B大也没说错 这样直接比的确比较方便 不过当电泳有问题时 06/19 00:49
40F：→ Fourfish:该一步步检查 当遇过同一plasmid抽出後跑出不同位置时 就 06/19 00:53
41F：→ Fourfish:会知道这样没比较快..我还遇过有insert的跑出来还比vecto 06/19 00:55
42F：→ Fourfish:r小的咧...size也不过就大概5k->6k 06/19 00:56
43F：→ Fourfish:不过我之前没注意到的是原PO说跑完胶没任何band 这比较奇 06/19 00:59
44F：推 conective:个人意见直接重作 而且要检讨ligation的实验条件与步骤 06/19 02:03
45F：→ conective:只有一颗可挑 切出来又没东西 成功机率已经不高了 06/19 02:04
46F：→ conective:建议原PO把construct的设计描述一下 请板上先进帮忙看 06/19 02:05
47F：→ conective:有时候作cloning检讨不出原因时 直接往前面的步骤重作 06/19 02:06
48F：→ conective:会比较快点 06/19 02:06
49F：→ turtle24:有些地方DNA定量之後比较方便找失败的原因 只是麻烦一些 06/19 10:35
50F：→ syming:嗯嗯 谢谢各位的意见 目前 我选择重做 PCR→切→ligation 06/19 19:16
目前我的作法是
insert≒ 1.5 kb
vector≒ 5.4 kb
(1) PCR
1. 95度 2min
2. 95度 30sec ←－
3. 55度 30sec | 25 cycles
4. 68度 3min30sec －－
5. 68度 15min
6. 4度
(2) digestion
PCR产物 跟vector用 EcoR1与HindIII 切一个小时
digestion condition
DNA(vector) = 6 uL / DNA(insert) = 10 uL
10X buffer = 2 uL
EcoR1 = 1 uL
HindIII = 1 uL
DI H2O = 10 uL / DI H2O = 6 uL
reaction for 37度 1hr
(3)
purification kit 纯化digestiont产物
电泳 确定有欲得的产物 (目前做到这幕都是OK的)
(4) ligation (目前无法完全掌握的一步)
insert = 4 uL
vector = 4 uL
ligase = 1 uL
10X buffer = 1 uL
(insert 从胶片上看起来浓於 vector，还是我需要把浓度给订出来比较好?
再以insert:vector = 5:1 or 3:1 去做ligation )
reaction condition (有三种条件)
1. 4度 overnight
2. 16度 overmight
3. 室温 1hr
transform to competent cell
不知各位先进 小弟有啥需 要改善的地方
谢谢
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (06/19 19:43)
51F：推 conective:纯化之後的insert和vector浓度可以测一下 06/19 22:33
52F：→ conective:提高insert/vector比 16度C overnight试试 06/19 22:35
53F：推 yaliu:感觉你是ligation到转型那边有问题～首先请问一下你primer 06/20 00:28
54F：→ yaliu:切位有无留几个mer??如果没有留直接切的话应该切不动喔 06/20 00:28
primer的设计 我有考虑到切位要多留几个mer的问题
所以我在切位前面
有多设计8个mer 用GGG CCC GG
这样primer的设计应该没啥太大的问题吧?
55F：→ yaliu:ligation喔～我好像都没在管比例的～我都insert弄爆多 06/20 00:30
56F：→ yaliu:因为vector感觉比较好得到，我会insert 7, vector 1吧 06/20 00:31
57F：→ yaliu:然後如果确定转型那边没问题，但就是ligation有问题 06/20 00:32
58F：→ yaliu:看看ligation buffer有没有问题，因为buffer的ATP如果没有 06/20 00:33
59F：→ yaliu:保存好很容易就坏掉之类的～给你参考罗 06/20 00:33
60F：推 bluecsky:跟楼上一样 我vector都只拿1 insert都塞到爆 4度C o/n 06/20 09:49
61F：→ bluecsky:ligation buffer看要不要在拿一个新的 确实满容易坏的 06/20 09:49
62F：→ bluecsky:毕竟有些人操作习惯不太好 buffer拿了用完也不马上冰好 06/20 09:50
63F：→ bluecsky:让他一直放在室温 好一点的飘在融化的冰水中... 06/20 09:50
64F：→ bluecsky:这样久了以後buffer很容易坏掉 06/20 09:51
我曾经有考虑过是不是ligation buffer ATP降解的问题
(因为中间 有搬过一次家)
所以我目前用新的 ligase与ligation buffer
可是都还没有成功 懊恼啊~~
所以想说请教板上的先进 我是不是作法有问题?!
像我ligation buffer 是在冰上回溶 ATP应该不会太快裂解吧?
用完也马上冰回20度 冰箱保存
真的感谢版上的先进 能跟小弟我讨论 谢谢
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (06/20 17:26)
65F：→ mtdas:我习惯买来就立即分装buffer 避免反覆解冻结冻 06/20 20:26
66F：→ mtdas:切位留8mer对EcoRI和HindIII很够了 R1我习惯留1mer H3留5mer 06/20 20:31
67F：推 yaliu:你elution是用buffer还是用水？用buffer可能效果会较差 06/21 08:18
68F：→ yaliu:再来可以确认一下转型有无问题～随便拿个质体试一下 06/21 08:19
69F：→ syming:嗯嗯 我是用buffer 之前有用过水 但是结果也一样 06/21 12:10
70F：→ syming:所以目前 在检查是不是competent cell没做好的问题~ 06/21 12:12
71F：→ jimmykiki:听起来像是ligation问题 insert放太多有可能两条自己就 06/24 10:08
72F：→ jimmykiki:黏回去了 你要不要把你看比例的胶图show出来看看 06/24 10:12
73F：→ jimmykiki:会长那麽少 大部分ligation问题是主因 06/24 10:16
74F：→ syming:两条黏回去?? 是说 两条insert黏在一起?会有这情形发生?? 06/24 12:41