作者ververia (假面下的冷漠與哀愁)
看板Biotech
標題[求救] HaCaT測ROS
時間Thu Jun 10 23:03:31 2010
我想做的是用P. acnes去誘發HaCaT產生ROS，並用H2O2當正對照組
不過還在建立模式，所以目前的實驗步驟和條件是先參考paper和同學的做法
實驗步驟如下：
1. HaCaT種在96-well plate，培養24小時
2. 用1×PBS wash 兩次，洗掉medium
3. 加100μL的DCFDA (100μM)，培養1小時 (在incubactor避光培養)
4. 用1×PBS wash 三次，甩乾
5. 加100μL的P. acnes 和 H2O2
(以DMEM稀釋，P. acnes濃度為200μg/ml，H2O2濃度為1、10、100mM)
6. 測15、30、60、120分鐘的螢光值 (同一盤重覆測，避光培養)
實驗結果：P. acnes和H2O2在四個時間點都沒有將ROS刺激起來
問題1：
H2O2我覺得有可能是因為開封後冰在冰箱有一段時間，說不定已經沒有效果
想請教如果之後要用新的H2O2做ROS，有哪些是需要注意的地方 (如：存放、步驟...)
濃度的部分是否需要再增加？還是說少量就足以促使細胞產生ROS？
問題2：
這次的實驗我有用不同濃度的DCFDA去測螢光值 (細胞數、菌數皆相同)
發現DCFDA的濃度越高，螢光值也越高，不曉得這代表的意義是什麼？
是否表示低濃度的情況下，細胞中的DCFDA是不飽和的？
DCFDA看paper使用的濃度都很低，有板友也只培養30 min，這部分應該如何修改？
問題3：
H2O2刺激產生的ROS很快，所以正常來說應該短時間就可以測到
P. acne的話，是有看到paper在短時間內就測ROS，
不過我自己比較疑惑的是P. acnes誘發產生的ROS會很快嗎?
問題4：
以這樣的實驗方式，應該先染色再刺激，還是先刺激再染色會比較適合？
謝謝各位~
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※ 編輯: ververia 來自: 140.122.30.16 (06/10 23:04)