作者ververia (假面下的冷漠与哀愁)
看板Biotech
标题[求救] HaCaT测ROS
时间Thu Jun 10 23:03:31 2010
我想做的是用P. acnes去诱发HaCaT产生ROS，并用H2O2当正对照组
不过还在建立模式，所以目前的实验步骤和条件是先参考paper和同学的做法
实验步骤如下：
1. HaCaT种在96-well plate，培养24小时
2. 用1×PBS wash 两次，洗掉medium
3. 加100μL的DCFDA (100μM)，培养1小时 (在incubactor避光培养)
4. 用1×PBS wash 三次，甩乾
5. 加100μL的P. acnes 和 H2O2
(以DMEM稀释，P. acnes浓度为200μg/ml，H2O2浓度为1、10、100mM)
6. 测15、30、60、120分钟的萤光值 (同一盘重覆测，避光培养)
实验结果：P. acnes和H2O2在四个时间点都没有将ROS刺激起来
问题1：
H2O2我觉得有可能是因为开封後冰在冰箱有一段时间，说不定已经没有效果
想请教如果之後要用新的H2O2做ROS，有哪些是需要注意的地方 (如：存放、步骤...)
浓度的部分是否需要再增加？还是说少量就足以促使细胞产生ROS？
问题2：
这次的实验我有用不同浓度的DCFDA去测萤光值 (细胞数、菌数皆相同)
发现DCFDA的浓度越高，萤光值也越高，不晓得这代表的意义是什麽？
是否表示低浓度的情况下，细胞中的DCFDA是不饱和的？
DCFDA看paper使用的浓度都很低，有板友也只培养30 min，这部分应该如何修改？
问题3：
H2O2刺激产生的ROS很快，所以正常来说应该短时间就可以测到
P. acne的话，是有看到paper在短时间内就测ROS，
不过我自己比较疑惑的是P. acnes诱发产生的ROS会很快吗?
问题4：
以这样的实验方式，应该先染色再刺激，还是先刺激再染色会比较适合？
谢谢各位~
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※ 编辑: ververia 来自: 140.122.30.16 (06/10 23:04)