作者Imsomniac (小小熱血生科人)
看板Biotech
標題[求救]一些實驗上的問題
時間Sun Jun 6 19:45:07 2010
先自介好了
小弟我是大二某生科系的學生 最近開始了生科系的實驗室人生~
現在老師給我的課題是:cell culture => transfect(GFP) => western blot
做了半學期後 我對於一些實驗原理還不是很明白
所以想來求救板上的大大們~
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一、作western blot時會用到SDS來使蛋白質依分子量分開，但同時也會讓蛋白質變性。
但蛋白質變性後，為何之後的一抗還能辨識目標蛋白質呢?
二、據我查到的資料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，這是什麼意思??
如果沒有做這個步驟，最後的照出來的結果會怎麼樣子(重要 我想知道他會長怎樣)?
還有牛奶不可為加鈣的人工添加牛奶，如果加入了其他東西會怎樣?
三、transfect方式選擇?
我看過很多網路的資料，DEAE-dextran的介紹還蠻少的，是因為現在不常用了嗎?
還有liposome聽說效率較高，適用的細胞株也比較多對嗎? 他有什麼限制?
四、Western blot最後的ECL是怎麼讓蛋白質顯影在底片上的?
我知道底片是因為電子打在上面，使銀離子沉澱，但是什麼發散電子的?
顯影劑的作用又是什麼? 為什麼兩個容易加在一起才能使蛋白質顯影?
五、繼代培養中的EDTA是做什麼用的?
我知道EDTA能除去鈣離子、鎂離子，但為什麼要除去這兩個?
還有細胞培養時都是用D_PBS(去除鈣離子、鎂離子的PBS)為什麼?
細胞不需要鈣離子、鎂離子嗎?
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大概就這些問題了，謝謝大大們解惑。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.137
1F：推 tsubasawolfy:帶你的學長姐沒解釋? 06/06 19:50
2F：→ Imsomniac:有些有問過 像第一個問題但學長說不太清楚 我也查不太到 06/06 20:40
3F：推 DannyUS:抗體是辨認蛋白質的N端orC端上的特定序列 所以儘管蛋白質 06/06 21:10
4F：→ DannyUS:已經變性被拉直了 但因為序列沒變 抗體還是能辨認到蛋白 06/06 21:11
5F：→ DannyUS:上面的特定序列 進而bind在上面 06/06 21:11
6F：推 loham:第二題,沒有blocking其實也不會怎樣,就是背景很髒而已 06/06 21:45
7F：→ loham:ECL是HRP的冷光受質,會發出化學冷光,使底片或影像系統感光 06/06 21:51
8F：→ loham:感光是感光,顯影是顯影,定影是定影 不一樣 06/06 21:53
9F：推 schmitt:第五題EDTA常和Trypsin一起當打下細胞的溶液. 06/06 23:12
10F：→ schmitt:相較於trypsin/HBSS，trypsin/EDTA會抓鈣離子，故會影響 06/06 23:13
11F：→ schmitt:某些細胞生長周期or貼附作用中需要用到鈣離子的情況 06/06 23:15
12F：→ schmitt:D_PBS我猜你是指DMEM/PBS，不同medium有不同的成分，適合 06/06 23:17
13F：→ schmitt:培養不同細胞，只是這樣而已，所以也有的細胞需要有鈣鎂的 06/06 23:18
14F：→ schmitt:D_PBS是最基礎的medium， 06/06 23:19
15F：→ NKTcell:第一個問題跟MHC呈現蛋白 還有抗體的產生過成有關 06/06 23:29
16F：推 loham:DPBS不是medium,DPBS是一種PBS的配方,比較貴~D是Dulbecco's 06/06 23:56
17F：→ loham:一般而言用PBS替代也幾乎沒什麼差 06/06 23:58
18F：推 loham:DMEM也不是最基礎的medium,如果medium用PBS泡鹽類應該偏高吧 06/07 00:01
19F：推 tsubasawolfy:第一題的也要看那隻抗體的製造方式 看是使用完整的 06/07 00:01
20F：→ tsubasawolfy:蛋白去誘發抗體抑或合成特定的序列去做單株抗體 06/07 00:02
21F：→ tsubasawolfy:所以抗體的datasheet上才會寫適合用在哪種實驗 06/07 00:02
22F：→ tsubasawolfy:第二題把membrane擺成側邊看▃ ▃ ▃ ▃ ▃ 06/07 00:04
23F：→ tsubasawolfy:凸起來的是轉過去的蛋白 凹槽則是well跟well之間的 06/07 00:05
24F：→ tsubasawolfy:距離 要填補的孔洞就是指這 不過這也要看Ab好壞 06/07 00:05
25F：→ tsubasawolfy:第三題lipo效率高 不容易死亡(也視細胞株而定) 06/07 00:08
26F：→ tsubasawolfy:而且可以包的DNA量有限制 還有其他transfect的方法 06/07 00:08
27F：→ tsubasawolfy:也在細胞死亡率 運送率 時間長短中玩翹翹板 06/07 00:09
28F：→ tsubasawolfy:第五題可以去查cell-cell junction中那兩個離子對 06/07 00:13
29F：→ tsubasawolfy:貼附蛋白的作用 或google EDTA,trypsin第一個就有 06/07 00:18
30F：推 core308:這些問題實驗室學長姐不知道...應該要檢討 06/07 01:58
31F：推 leoblack:樓上~術業有專攻,有些東西不一定每個人都學過~且原po才大 06/07 05:06
32F：→ leoblack:二,他的學長姐搞不好才大三四而已~有些東西我也是到了研 06/07 05:07
33F：→ leoblack:究所才學會的~ 06/07 05:08
34F：推 boblu:純推優良發問態度 06/07 08:01
35F：推 robertkoch:第二大題的第三子問題 06/07 20:44
36F：→ robertkoch:俺用過脫脂奶粉和脫脂"高鈣"奶粉XD 結果沒差^^ 06/07 20:46
37F：推 DFS:用過期n年的安佳沒+鈣洗完的背景比現在全聯賣的安佳乾淨 06/07 21:26