作者Imsomniac (小小热血生科人)
看板Biotech
标题[求救]一些实验上的问题
时间Sun Jun 6 19:45:07 2010
先自介好了
小弟我是大二某生科系的学生 最近开始了生科系的实验室人生~
现在老师给我的课题是:cell culture => transfect(GFP) => western blot
做了半学期後 我对於一些实验原理还不是很明白
所以想来求救板上的大大们~
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一、作western blot时会用到SDS来使蛋白质依分子量分开，但同时也会让蛋白质变性。
但蛋白质变性後，为何之後的一抗还能辨识目标蛋白质呢?
二、据我查到的资料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，这是什麽意思??
如果没有做这个步骤，最後的照出来的结果会怎麽样子(重要 我想知道他会长怎样)?
还有牛奶不可为加钙的人工添加牛奶，如果加入了其他东西会怎样?
三、transfect方式选择?
我看过很多网路的资料，DEAE-dextran的介绍还蛮少的，是因为现在不常用了吗?
还有liposome听说效率较高，适用的细胞株也比较多对吗? 他有什麽限制?
四、Western blot最後的ECL是怎麽让蛋白质显影在底片上的?
我知道底片是因为电子打在上面，使银离子沉淀，但是什麽发散电子的?
显影剂的作用又是什麽? 为什麽两个容易加在一起才能使蛋白质显影?
五、继代培养中的EDTA是做什麽用的?
我知道EDTA能除去钙离子、镁离子，但为什麽要除去这两个?
还有细胞培养时都是用D_PBS(去除钙离子、镁离子的PBS)为什麽?
细胞不需要钙离子、镁离子吗?
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大概就这些问题了，谢谢大大们解惑。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.137
1F：推 tsubasawolfy:带你的学长姐没解释? 06/06 19:50
2F：→ Imsomniac:有些有问过 像第一个问题但学长说不太清楚 我也查不太到 06/06 20:40
3F：推 DannyUS:抗体是辨认蛋白质的N端orC端上的特定序列 所以尽管蛋白质 06/06 21:10
4F：→ DannyUS:已经变性被拉直了 但因为序列没变 抗体还是能辨认到蛋白 06/06 21:11
5F：→ DannyUS:上面的特定序列 进而bind在上面 06/06 21:11
6F：推 loham:第二题,没有blocking其实也不会怎样,就是背景很脏而已 06/06 21:45
7F：→ loham:ECL是HRP的冷光受质,会发出化学冷光,使底片或影像系统感光 06/06 21:51
8F：→ loham:感光是感光,显影是显影,定影是定影 不一样 06/06 21:53
9F：推 schmitt:第五题EDTA常和Trypsin一起当打下细胞的溶液. 06/06 23:12
10F：→ schmitt:相较於trypsin/HBSS，trypsin/EDTA会抓钙离子，故会影响 06/06 23:13
11F：→ schmitt:某些细胞生长周期or贴附作用中需要用到钙离子的情况 06/06 23:15
12F：→ schmitt:D_PBS我猜你是指DMEM/PBS，不同medium有不同的成分，适合 06/06 23:17
13F：→ schmitt:培养不同细胞，只是这样而已，所以也有的细胞需要有钙镁的 06/06 23:18
14F：→ schmitt:D_PBS是最基础的medium， 06/06 23:19
15F：→ NKTcell:第一个问题跟MHC呈现蛋白 还有抗体的产生过成有关 06/06 23:29
16F：推 loham:DPBS不是medium,DPBS是一种PBS的配方,比较贵~D是Dulbecco's 06/06 23:56
17F：→ loham:一般而言用PBS替代也几乎没什麽差 06/06 23:58
18F：推 loham:DMEM也不是最基础的medium,如果medium用PBS泡盐类应该偏高吧 06/07 00:01
19F：推 tsubasawolfy:第一题的也要看那只抗体的制造方式 看是使用完整的 06/07 00:01
20F：→ tsubasawolfy:蛋白去诱发抗体抑或合成特定的序列去做单株抗体 06/07 00:02
21F：→ tsubasawolfy:所以抗体的datasheet上才会写适合用在哪种实验 06/07 00:02
22F：→ tsubasawolfy:第二题把membrane摆成侧边看▃ ▃ ▃ ▃ ▃ 06/07 00:04
23F：→ tsubasawolfy:凸起来的是转过去的蛋白 凹槽则是well跟well之间的 06/07 00:05
24F：→ tsubasawolfy:距离 要填补的孔洞就是指这 不过这也要看Ab好坏 06/07 00:05
25F：→ tsubasawolfy:第三题lipo效率高 不容易死亡(也视细胞株而定) 06/07 00:08
26F：→ tsubasawolfy:而且可以包的DNA量有限制 还有其他transfect的方法 06/07 00:08
27F：→ tsubasawolfy:也在细胞死亡率 运送率 时间长短中玩翘翘板 06/07 00:09
28F：→ tsubasawolfy:第五题可以去查cell-cell junction中那两个离子对 06/07 00:13
29F：→ tsubasawolfy:贴附蛋白的作用 或google EDTA,trypsin第一个就有 06/07 00:18
30F：推 core308:这些问题实验室学长姐不知道...应该要检讨 06/07 01:58
31F：推 leoblack:楼上~术业有专攻,有些东西不一定每个人都学过~且原po才大 06/07 05:06
32F：→ leoblack:二,他的学长姐搞不好才大三四而已~有些东西我也是到了研 06/07 05:07
33F：→ leoblack:究所才学会的~ 06/07 05:08
34F：推 boblu:纯推优良发问态度 06/07 08:01
35F：推 robertkoch:第二大题的第三子问题 06/07 20:44
36F：→ robertkoch:俺用过脱脂奶粉和脱脂"高钙"奶粉XD 结果没差^^ 06/07 20:46
37F：推 DFS:用过期n年的安佳没+钙洗完的背景比现在全联卖的安佳乾净 06/07 21:26