作者ricebaby (小蘋兒)
看板Biotech
標題[求救] 純化soluble protein時~在binding buffer可添加TitonX100?
時間Mon May 31 18:35:31 2010
請問各位 如果我想要純化soluble protein
在誘導後離心去掉上清液後
以binding buffer回溶(之後要用 Ni-NTA column作純化)此時的binding buffer
是50mM tris-HCl
500mM NaCl(可以不加這個嗎 是不是可以更容易在wash的時候洗掉非專一性的
蛋白質呢)
2mM PMSF
可以加0.5-1%的Triton X-100嗎?會不會造成他的構型改變呢?
此時的imidazole我查到的資料有兩種說法耶
一種是binding buffer不含imidazole resin的結合比較好 比較不會bind到雜蛋白
一種是大約5-10mMimidazole 說是這樣比較可以先洗掉一些非專一性的雜蛋白
以上問題 麻煩大家><感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.49.158
1F：→ turtle24:使用前請參閱說明書... 05/31 18:58
2F：→ tsubasawolfy:為何會想加TritonX100呢? 又一般bindingbuf會加微量 05/31 19:53
3F：→ tsubasawolfy:imidazole...NaCl看你蛋白溶解度.. 05/31 19:54
4F：→ kshsdeck:binding buffer可以加10mM Imidazole 05/31 22:14
5F：→ kshsdeck:主要是靠wash這個步驟 05/31 22:16
6F：→ kshsdeck:wash buffer的Imidazole濃度 05/31 22:16
7F：→ kshsdeck:要看目標蛋白和雜蛋白與resin結合能力的差距 05/31 22:16
8F：→ kshsdeck:拉個gradient或是階層式的提高imidazole的濃度 05/31 22:18
9F：→ kshsdeck:看你目標蛋白和主要雜蛋白peak出來時,Imidazole的濃度 05/31 22:18
10F：→ kshsdeck:運氣好你要的蛋白結合力強,wash buffer濃度就可以提高 05/31 22:20
11F：→ kshsdeck:就可以盡量洗掉雜蛋白 05/31 22:23
12F：→ kshsdeck:一般來說,只用一根Ni-column,不容易拿到很pure的蛋白 05/31 22:25
13F：→ kshsdeck:purity和yeild兩者要取平衡點 05/31 22:26
14F：→ pirl:不要說的太難懂..他已經碩二要畢業了...還不會算莫爾濃度 05/31 22:40
15F：→ pirl:不敢保證配的藥品濃度會正確.... 05/31 22:41
16F：推 tsubasawolfy:高純度就會低產率 高產率就低純度 看用途而定 05/31 23:36
17F：推 bluecsky:binding buffer加imidazole才比較不會bind雜蛋白吧.. 06/01 04:28
18F：→ bluecsky:總之如上所說 產率跟純度要自己依用途選擇 06/01 04:29
19F：→ bluecsky:一般這邊純化完後大多還會跑別的cloumn以求更純的蛋白 06/01 04:30
20F：推 biingru:感覺原po好像實驗室只有他一個人？！ 06/01 10:32
21F：→ Aquariusboy:樓上的大大，往上六樓推文就是正解 其他的 自己意會.. 06/01 14:35
22F：→ pirl:因為他是特聘研究生....跟其他同學不一樣 06/01 14:35
23F：推 biingru:這樣我就理解了XD 06/01 21:51
24F：推 A000111:想加TitonX100 是想增加膜蛋白溶解度吧? 06/02 01:51
25F：→ ricebaby:是滴 是想要加增加膜蛋白的溶解度 可是又怕破壞它的結構 06/02 03:29
26F：→ A000111:小弟我也是最近開始研究膜蛋白的純化條件..還在學習..>< 06/02 22:11