作者ricebaby (小苹儿)
看板Biotech
标题[求救] 纯化soluble protein时~在binding buffer可添加TitonX100?
时间Mon May 31 18:35:31 2010
请问各位 如果我想要纯化soluble protein
在诱导後离心去掉上清液後
以binding buffer回溶(之後要用 Ni-NTA column作纯化)此时的binding buffer
是50mM tris-HCl
500mM NaCl(可以不加这个吗 是不是可以更容易在wash的时候洗掉非专一性的
蛋白质呢)
2mM PMSF
可以加0.5-1%的Triton X-100吗?会不会造成他的构型改变呢?
此时的imidazole我查到的资料有两种说法耶
一种是binding buffer不含imidazole resin的结合比较好 比较不会bind到杂蛋白
一种是大约5-10mMimidazole 说是这样比较可以先洗掉一些非专一性的杂蛋白
以上问题 麻烦大家><感谢
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◆ From: 140.109.49.158
1F：→ turtle24:使用前请参阅说明书... 05/31 18:58
2F：→ tsubasawolfy:为何会想加TritonX100呢? 又一般bindingbuf会加微量 05/31 19:53
3F：→ tsubasawolfy:imidazole...NaCl看你蛋白溶解度.. 05/31 19:54
4F：→ kshsdeck:binding buffer可以加10mM Imidazole 05/31 22:14
5F：→ kshsdeck:主要是靠wash这个步骤 05/31 22:16
6F：→ kshsdeck:wash buffer的Imidazole浓度 05/31 22:16
7F：→ kshsdeck:要看目标蛋白和杂蛋白与resin结合能力的差距 05/31 22:16
8F：→ kshsdeck:拉个gradient或是阶层式的提高imidazole的浓度 05/31 22:18
9F：→ kshsdeck:看你目标蛋白和主要杂蛋白peak出来时,Imidazole的浓度 05/31 22:18
10F：→ kshsdeck:运气好你要的蛋白结合力强,wash buffer浓度就可以提高 05/31 22:20
11F：→ kshsdeck:就可以尽量洗掉杂蛋白 05/31 22:23
12F：→ kshsdeck:一般来说,只用一根Ni-column,不容易拿到很pure的蛋白 05/31 22:25
13F：→ kshsdeck:purity和yeild两者要取平衡点 05/31 22:26
14F：→ pirl:不要说的太难懂..他已经硕二要毕业了...还不会算莫尔浓度 05/31 22:40
15F：→ pirl:不敢保证配的药品浓度会正确.... 05/31 22:41
16F：推 tsubasawolfy:高纯度就会低产率 高产率就低纯度 看用途而定 05/31 23:36
17F：推 bluecsky:binding buffer加imidazole才比较不会bind杂蛋白吧.. 06/01 04:28
18F：→ bluecsky:总之如上所说 产率跟纯度要自己依用途选择 06/01 04:29
19F：→ bluecsky:一般这边纯化完後大多还会跑别的cloumn以求更纯的蛋白 06/01 04:30
20F：推 biingru:感觉原po好像实验室只有他一个人？！ 06/01 10:32
21F：→ Aquariusboy:楼上的大大，往上六楼推文就是正解 其他的 自己意会.. 06/01 14:35
22F：→ pirl:因为他是特聘研究生....跟其他同学不一样 06/01 14:35
23F：推 biingru:这样我就理解了XD 06/01 21:51
24F：推 A000111:想加TitonX100 是想增加膜蛋白溶解度吧? 06/02 01:51
25F：→ ricebaby:是滴 是想要加增加膜蛋白的溶解度 可是又怕破坏它的结构 06/02 03:29
26F：→ A000111:小弟我也是最近开始研究膜蛋白的纯化条件..还在学习..>< 06/02 22:11