作者championelmo (elmo軒)
看板Biotech
標題[求救] 請教有做過sticky-end PCR的前輩
時間Mon May 31 16:56:55 2010
各位大家好
最近我在準備做sticky-end PCR的前置作業
在網路上找到了一份Protocol
裡面提到在兩管個別做完後
先用PCR Cleaning kit純化
最後在elute的時候使用0.1X TE buffer
再加入PCR時所使用的buffer
再拿去denature and re-nature
我的問題是在用kit純化後他建議使用的elute buffer
是有必須要這樣用嗎?
或是大家有用過其他的方法 可以給我一些建議
謝謝~~~~
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◆ From: 140.124.250.117
1F：推 kingtiger:用TE是比較好,基本上elute用ddH2O也是做得出來 05/31 18:00
2F：推 bluecsky:TE是保存方面比較好 用水也可以 兩者都用過 05/31 18:05
3F：推 Ice9:用 Tris 比較好，有 EDTA 的話會影響之後酵素的反應。 05/31 18:06
4F：推 tsubasawolfy:他後續的實驗也就dimer起來 酒精沉澱or用pcr clean 05/31 19:46
5F：→ tsubasawolfy:kit 不管形成dimer時用水或TE後面一樣都可以換掉 05/31 19:48
6F：→ tsubasawolfy:然後就是很high的無CIP處理ligation 05/31 19:49
7F：→ tsubasawolfy:作成dimer那部分用水或TE都可以 05/31 19:50
8F：→ bluecsky:可以把重新配對後的PCR product做PNK處理 06/01 04:32
9F：→ bluecsky:vector依然可以CIP處理 要是你能確定vector切很好 06/01 04:32
10F：→ bluecsky:不CIP處理也沒什麼不好 再來這方法比較麻煩一點在於 06/01 04:33
11F：→ bluecsky:其實重新混合後 理論上大約只有1/4是你要的配對 06/01 04:33
12F：→ bluecsky:不過也就這1/4是有辦法ligation的 只是加反應時自己要 06/01 04:34
13F：→ bluecsky:稍微注意一下量的比例 06/01 04:34
14F：推 tsubasawolfy:兩端都沒有P的ligation產量不更低Orz 06/01 08:41
15F：推 bluecsky:還好耶 我個人操作 vector有無CIP處理都可以做出來 06/01 12:11
16F：→ bluecsky:cloning拿到一個對的就好了 拿一整盤也不會比較有用 06/01 12:12
17F：→ bluecsky:有時候長滿盤我還比較擔心.. 06/01 12:12
18F：→ Ice9:可以考慮先磷酸化 primers 再做 PCR。 06/01 14:16