作者championelmo (elmo轩)
看板Biotech
标题[求救] 请教有做过sticky-end PCR的前辈
时间Mon May 31 16:56:55 2010
各位大家好
最近我在准备做sticky-end PCR的前置作业
在网路上找到了一份Protocol
里面提到在两管个别做完後
先用PCR Cleaning kit纯化
最後在elute的时候使用0.1X TE buffer
再加入PCR时所使用的buffer
再拿去denature and re-nature
我的问题是在用kit纯化後他建议使用的elute buffer
是有必须要这样用吗?
或是大家有用过其他的方法 可以给我一些建议
谢谢~~~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.124.250.117
1F：推 kingtiger:用TE是比较好,基本上elute用ddH2O也是做得出来 05/31 18:00
2F：推 bluecsky:TE是保存方面比较好 用水也可以 两者都用过 05/31 18:05
3F：推 Ice9:用 Tris 比较好，有 EDTA 的话会影响之後酵素的反应。 05/31 18:06
4F：推 tsubasawolfy:他後续的实验也就dimer起来 酒精沉淀or用pcr clean 05/31 19:46
5F：→ tsubasawolfy:kit 不管形成dimer时用水或TE後面一样都可以换掉 05/31 19:48
6F：→ tsubasawolfy:然後就是很high的无CIP处理ligation 05/31 19:49
7F：→ tsubasawolfy:作成dimer那部分用水或TE都可以 05/31 19:50
8F：→ bluecsky:可以把重新配对後的PCR product做PNK处理 06/01 04:32
9F：→ bluecsky:vector依然可以CIP处理 要是你能确定vector切很好 06/01 04:32
10F：→ bluecsky:不CIP处理也没什麽不好 再来这方法比较麻烦一点在於 06/01 04:33
11F：→ bluecsky:其实重新混合後 理论上大约只有1/4是你要的配对 06/01 04:33
12F：→ bluecsky:不过也就这1/4是有办法ligation的 只是加反应时自己要 06/01 04:34
13F：→ bluecsky:稍微注意一下量的比例 06/01 04:34
14F：推 tsubasawolfy:两端都没有P的ligation产量不更低Orz 06/01 08:41
15F：推 bluecsky:还好耶 我个人操作 vector有无CIP处理都可以做出来 06/01 12:11
16F：→ bluecsky:cloning拿到一个对的就好了 拿一整盘也不会比较有用 06/01 12:12
17F：→ bluecsky:有时候长满盘我还比较担心.. 06/01 12:12
18F：→ Ice9:可以考虑先磷酸化 primers 再做 PCR。 06/01 14:16