作者CakeCola (嘛哈)
看板Biotech
標題[求救] 請問293T做transfection
時間Sun May 30 23:13:56 2010
大家好
小弟最近才開始做細胞實驗
用293T cell line做transfection
目的是要表現某個基因，收蛋白做EMSA
使用6cm dish
2.5ml DMEM (no FBS)+5ul plasmid(1ug/ul) + 5ul lipofectamine 2000
加入後隔天把meduim吸掉加入含有FBS的DMEM
但是
本來都好好的
但把medium抽掉並加入D含FBSMEM後
所有細胞都 "漂起來了"
即使我是從dish的壁緩慢加入也是一樣
本來是貼著底部的
後來幾乎全部細胞都漂起來了
而且漂起來後也不會貼回去
所以就不能用了
有給其他養過細胞的同事看過
他們認為細胞其實沒有死掉
後來我就乾脆不換medium
直接transfection 48hr
今天看48hr的細胞其實還OK
但是我抽ptotein的kit中寫道
把medium抽掉後要用cilled PBS洗一下
所以我今天就用PBS洗了一下(用1000 pipetman由dish壁緩慢加入)
加下去就馬上吸起來
還是很多細胞一加下去就漂起來了
最後雖然還是有繼續做下去並把protein抽完
但我損失了蠻多細胞的
所以293T transfect後加入東西(medium,PBS)會漂起來
一直很困擾我
而且我也不知道為什麼不會再貼回去
請問有做293T的朋友可以提供解決方法嗎
謝謝各位
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◆ From: 219.85.129.28
1F：推 kingtiger:293T本身很容易飄,處理的時後得小心點 05/30 23:17
2F：→ CakeCola:sorry有看到5014有問一樣的問題，想請問一下我們lab有 05/30 23:18
3F：→ kingtiger:我是用tip延著well的壁慢慢吸,慢慢加,可以減少損失 05/30 23:19
4F：→ CakeCola:好像叫S fect，請問這可以用嗎，謝謝 05/30 23:19
5F：推 aggaci:293T用lipofectamine的話細胞密度要高一點，毒性才不會強 05/30 23:49
6F：→ aggaci:另外293T我推薦用CaPO4做transfection...效果不錯又便宜！ 05/30 23:49
7F：推 liuse:用CaPO4即可 效率極好 又不會飄 05/30 23:58
8F：推 snowypuppy:可以在種細胞前用0.2mg/ml的PDL coating plate約一小時 05/31 01:55
9F：→ snowypuppy:細胞貼附的狀況會好很多,另外CaPO4效果的確不錯 05/31 01:55
10F：→ snowypuppy:我們家用lipofectamine會6小時就換medium避免細胞毒性 05/31 01:56
11F：→ snowypuppy:但之後的實驗處理還要wash,我建議你試試coating看看 05/31 01:57
12F：→ rimeni:CaPO4可以在full medium中使用嗎? 05/31 03:20
13F：推 snowypuppy:我家做CaPO4是用full medium 05/31 03:41
14F：推 celestial318:可以把飄起來的細胞一起收下來做實驗 05/31 10:15
15F：推 iceking:transfection 4~6hr就要換medium,不然細胞都被毒死 05/31 12:02
16F：→ iceking:何況lipofectamine毒性強,293T又容易飄 05/31 12:03
17F：推 icome:我養的293T更嬌嫩...連換個medium也飄給我看 05/31 12:34
18F：→ CakeCola:請問使用NaPO4要怎麼做? 05/31 13:31
19F：→ CakeCola:說錯 是CaPO4 05/31 13:32
20F：推 iceking:google搜尋 CaPO4 transfection 05/31 14:32
21F：推 atunna:細胞要多一點 七成滿左右 五個小時後換medium 06/05 15:31
22F：→ atunna:2000很好用但貴 用在293上有點大材小用 06/05 15:33
23F：推 cloud74115:可以測一下PH，太鹼的話加下去馬上飄給你看 06/11 17:22