作者CakeCola (嘛哈)
看板Biotech
标题[求救] 请问293T做transfection
时间Sun May 30 23:13:56 2010
大家好
小弟最近才开始做细胞实验
用293T cell line做transfection
目的是要表现某个基因，收蛋白做EMSA
使用6cm dish
2.5ml DMEM (no FBS)+5ul plasmid(1ug/ul) + 5ul lipofectamine 2000
加入後隔天把meduim吸掉加入含有FBS的DMEM
但是
本来都好好的
但把medium抽掉并加入D含FBSMEM後
所有细胞都 "漂起来了"
即使我是从dish的壁缓慢加入也是一样
本来是贴着底部的
後来几乎全部细胞都漂起来了
而且漂起来後也不会贴回去
所以就不能用了
有给其他养过细胞的同事看过
他们认为细胞其实没有死掉
後来我就乾脆不换medium
直接transfection 48hr
今天看48hr的细胞其实还OK
但是我抽ptotein的kit中写道
把medium抽掉後要用cilled PBS洗一下
所以我今天就用PBS洗了一下(用1000 pipetman由dish壁缓慢加入)
加下去就马上吸起来
还是很多细胞一加下去就漂起来了
最後虽然还是有继续做下去并把protein抽完
但我损失了蛮多细胞的
所以293T transfect後加入东西(medium,PBS)会漂起来
一直很困扰我
而且我也不知道为什麽不会再贴回去
请问有做293T的朋友可以提供解决方法吗
谢谢各位
--
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 219.85.129.28
1F：推 kingtiger:293T本身很容易飘,处理的时後得小心点 05/30 23:17
2F：→ CakeCola:sorry有看到5014有问一样的问题，想请问一下我们lab有 05/30 23:18
3F：→ kingtiger:我是用tip延着well的壁慢慢吸,慢慢加,可以减少损失 05/30 23:19
4F：→ CakeCola:好像叫S fect，请问这可以用吗，谢谢 05/30 23:19
5F：推 aggaci:293T用lipofectamine的话细胞密度要高一点，毒性才不会强 05/30 23:49
6F：→ aggaci:另外293T我推荐用CaPO4做transfection...效果不错又便宜！ 05/30 23:49
7F：推 liuse:用CaPO4即可 效率极好 又不会飘 05/30 23:58
8F：推 snowypuppy:可以在种细胞前用0.2mg/ml的PDL coating plate约一小时 05/31 01:55
9F：→ snowypuppy:细胞贴附的状况会好很多,另外CaPO4效果的确不错 05/31 01:55
10F：→ snowypuppy:我们家用lipofectamine会6小时就换medium避免细胞毒性 05/31 01:56
11F：→ snowypuppy:但之後的实验处理还要wash,我建议你试试coating看看 05/31 01:57
12F：→ rimeni:CaPO4可以在full medium中使用吗? 05/31 03:20
13F：推 snowypuppy:我家做CaPO4是用full medium 05/31 03:41
14F：推 celestial318:可以把飘起来的细胞一起收下来做实验 05/31 10:15
15F：推 iceking:transfection 4~6hr就要换medium,不然细胞都被毒死 05/31 12:02
16F：→ iceking:何况lipofectamine毒性强,293T又容易飘 05/31 12:03
17F：推 icome:我养的293T更娇嫩...连换个medium也飘给我看 05/31 12:34
18F：→ CakeCola:请问使用NaPO4要怎麽做? 05/31 13:31
19F：→ CakeCola:说错 是CaPO4 05/31 13:32
20F：推 iceking:google搜寻 CaPO4 transfection 05/31 14:32
21F：推 atunna:细胞要多一点 七成满左右 五个小时後换medium 06/05 15:31
22F：→ atunna:2000很好用但贵 用在293上有点大材小用 06/05 15:33
23F：推 cloud74115:可以测一下PH，太硷的话加下去马上飘给你看 06/11 17:22