作者dodomilk (豆漿)
看板Biotech
標題[求救] primer訂製出錯的可能性？
時間Wed May 26 10:54:20 2010
目前ligation遇到了瓶頸，交叉測試之後
認為問題所在可能是primer上RE認的位置及切位
所作的測試如下
兩種RE算過濃度後，各自單獨切vector，成功 => RE及buffer沒問題
被切一刀的vector作ligation，成功 => ligase及ligase buffer沒問題
competent cell使用vector作transformation測試，成功 => competent cell沒問題
現在能想到的可能性，只有在作insert的PCR時，所使用的primer有問題
RE認的位置或切位可能不對，造成RE根本沒切到insert
接下來應該會用TA cloning確認
請問有人碰過跟廠商訂primer時出錯的情況嗎？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.44.46
1F：→ skybreeze:之前有聽過有些廠商 合成primer會出錯 05/26 11:22
2F：推 iceking:有可能,而且機率不算低 05/26 12:48
3F：推 ROKEE:有, 遇過, 明X 05/26 12:56
4F：→ dodomilk:我就是跟明X訂的... 05/26 13:10
5F：推 bee921:遇過 我把定序檔給他們看 馬上重合一條給我 可以試看看 05/26 15:44
6F：→ mzac1b:定序才能知道有沒有錯 05/26 15:53
7F：→ mzac1b:我對明X 的經驗倒是沒遇過錯 05/26 15:54
8F：推 sheepfeather:我也是明X...讓我多搞了快1個月 = = 05/26 17:46
9F：推 icome:要定序才知道 insert本來就會比較難切 你有切比較久試試看嗎 05/26 17:58
10F：推 tsubasawolfy:NEB有提供哪種enzyme需要oligo多幾個mer還有效率 05/26 18:41
11F：→ tsubasawolfy:incubation的時間長短 所需的Unit 05/26 18:42
12F：→ dodomilk:我用的是SapI及XhoI, primer在RE位置之前有多設計六個bp 05/26 20:52
13F：→ dodomilk:也有按照DNA濃度加適量Unit的RE 05/26 20:53
14F：→ chaunen:inser切完跑膠看一下有沒有東西吧 05/26 22:39
15F：→ chaunen:說錯 是PCR完 05/26 22:39
16F：→ dodomilk:有 PCR完我會切下正確長度的band作ligation 05/26 23:38
17F：→ mzac1b:把你的PCR產物作TA cloning 然後再切 或拿去定序 05/26 23:46
18F：→ dodomilk:嗯 我接下來就是要這樣做 05/27 01:19
19F：推 bluecsky:本來就有可能出錯 確定出錯的話就馬上打去叫他們重做 05/27 07:28
20F：推 icome:gel extration得到的產物會比較難接進去! 建議直接clean up 05/27 11:46
21F：→ icome:根據某老闆的說法是 EtBr會影響ligation效率 05/27 11:47
22F：→ chiasaiqueen:PCR extension時間沒給夠，兩端沒做完也會接不上。 06/03 16:16