作者dodomilk (豆浆)
看板Biotech
标题[求救] primer订制出错的可能性？
时间Wed May 26 10:54:20 2010
目前ligation遇到了瓶颈，交叉测试之後
认为问题所在可能是primer上RE认的位置及切位
所作的测试如下
两种RE算过浓度後，各自单独切vector，成功 => RE及buffer没问题
被切一刀的vector作ligation，成功 => ligase及ligase buffer没问题
competent cell使用vector作transformation测试，成功 => competent cell没问题
现在能想到的可能性，只有在作insert的PCR时，所使用的primer有问题
RE认的位置或切位可能不对，造成RE根本没切到insert
接下来应该会用TA cloning确认
请问有人碰过跟厂商订primer时出错的情况吗？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.44.46
1F：→ skybreeze:之前有听过有些厂商 合成primer会出错 05/26 11:22
2F：推 iceking:有可能,而且机率不算低 05/26 12:48
3F：推 ROKEE:有, 遇过, 明X 05/26 12:56
4F：→ dodomilk:我就是跟明X订的... 05/26 13:10
5F：推 bee921:遇过 我把定序档给他们看 马上重合一条给我 可以试看看 05/26 15:44
6F：→ mzac1b:定序才能知道有没有错 05/26 15:53
7F：→ mzac1b:我对明X 的经验倒是没遇过错 05/26 15:54
8F：推 sheepfeather:我也是明X...让我多搞了快1个月 = = 05/26 17:46
9F：推 icome:要定序才知道 insert本来就会比较难切 你有切比较久试试看吗 05/26 17:58
10F：推 tsubasawolfy:NEB有提供哪种enzyme需要oligo多几个mer还有效率 05/26 18:41
11F：→ tsubasawolfy:incubation的时间长短 所需的Unit 05/26 18:42
12F：→ dodomilk:我用的是SapI及XhoI, primer在RE位置之前有多设计六个bp 05/26 20:52
13F：→ dodomilk:也有按照DNA浓度加适量Unit的RE 05/26 20:53
14F：→ chaunen:inser切完跑胶看一下有没有东西吧 05/26 22:39
15F：→ chaunen:说错 是PCR完 05/26 22:39
16F：→ dodomilk:有 PCR完我会切下正确长度的band作ligation 05/26 23:38
17F：→ mzac1b:把你的PCR产物作TA cloning 然後再切 或拿去定序 05/26 23:46
18F：→ dodomilk:嗯 我接下来就是要这样做 05/27 01:19
19F：推 bluecsky:本来就有可能出错 确定出错的话就马上打去叫他们重做 05/27 07:28
20F：推 icome:gel extration得到的产物会比较难接进去! 建议直接clean up 05/27 11:46
21F：→ icome:根据某老板的说法是 EtBr会影响ligation效率 05/27 11:47
22F：→ chiasaiqueen:PCR extension时间没给够，两端没做完也会接不上。 06/03 16:16