※ 引述《ricebaby (小蘋兒)》之銘言： : 請問各位 : 小妹最近要將表現的蛋白質利用Ni-NTA column純化出來 : 我的步驟是 : 1.先packing lml的resin : 2.用10 ml ddH2O wash : 3.用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) : 4.通入sample 和resin均勻混合10mins(置入冰箱) : 反覆binding三次 : 5.加入10 ml binding buffer : 6.加入10 ml wash buffer(含有20mM imidazole) : 7.加入10 ml elute buffer(含有250mM imidazole) : 8.加入用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) : 9.用10 ml ddH2O wash : 10.置換20% EtOH保存column : 可是Elute出來超多雜band 所以我就用elute出來確定有target protein的兩管 : 混合在一起 然後再通一次column 這次有將wash的 imidazole 濃度提高到50mM : 這是Elute出來的雜band就有比較少 可是還是有兩條雜band : 但是將對的目標蛋白質的量也比較少 : 而通第二次column後的wash我也有跑膠 都沒有任何的band出現 : 請問各位 如果我之後要再通column 可是直接在wash 的部分改變imidazloe的濃度嗎? : 像是50mM收5ml 75mM收5ml 100mM收5ml然後再用 250mM去elute 這樣可行嗎? : 還有一點很怪的是 我之前有取破菌後的上清和pellet來跑膠 : 得到的結果是soluble 和inclusion body(目標蛋白質比較多)都有 : 因此我將誘導後的菌液離心收pellet後 用native binding buffer : 去用Freanch press破菌 然後再用13000rpm,10min 離心後取上清 通一管column : 得到上面的結果 pellet的部分 我用含有8M urea去回溶 之後wash elute都是用 : 根native一樣的buffer但是整體的雜蛋白質和目標蛋白質都很少 是為什麼呢? : 照一開始破菌後跑膠的結果 應該是inclsion body的目標蛋白質比較多壓?? : 怎麼通過column出來反而少呢? : 感謝各位 我們家是用FPLC搭配管柱使用 管柱體積比原PO的稍微大一點 我的作法是在外邊把resin加熱到50度上下真空去氣 然後在把前面含有的Ni離子全部洗脫(EDTA) 再重新recharge loading的時候是直接把樣品通入管柱(這一點和原PO不大一樣) 老闆有說過原PO的方法似乎不是很理想,理由我忘記了(老師在講沒在聽) Elute的時候我們會先用10%的elution buffer elute大概6倍管柱體積(我會洗到七八倍) 不我一時想不起來是用多少濃度的imidazole去洗非專一性的protein 真的要試試看的話再寄信給我 當然誠如推文所建議 拉梯度會很好 至於inclusion body 我記得原PO前文提到是用pET system pET system mannual有inclusion body處理的方法~ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.59.89.64