※ 引述《ricebaby (小苹儿)》之铭言： : 请问各位 : 小妹最近要将表现的蛋白质利用Ni-NTA column纯化出来 : 我的步骤是 : 1.先packing lml的resin : 2.用10 ml ddH2O wash : 3.用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) : 4.通入sample 和resin均匀混合10mins(置入冰箱) : 反覆binding三次 : 5.加入10 ml binding buffer : 6.加入10 ml wash buffer(含有20mM imidazole) : 7.加入10 ml elute buffer(含有250mM imidazole) : 8.加入用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) : 9.用10 ml ddH2O wash : 10.置换20% EtOH保存column : 可是Elute出来超多杂band 所以我就用elute出来确定有target protein的两管 : 混合在一起 然後再通一次column 这次有将wash的 imidazole 浓度提高到50mM : 这是Elute出来的杂band就有比较少 可是还是有两条杂band : 但是将对的目标蛋白质的量也比较少 : 而通第二次column後的wash我也有跑胶 都没有任何的band出现 : 请问各位 如果我之後要再通column 可是直接在wash 的部分改变imidazloe的浓度吗? : 像是50mM收5ml 75mM收5ml 100mM收5ml然後再用 250mM去elute 这样可行吗? : 还有一点很怪的是 我之前有取破菌後的上清和pellet来跑胶 : 得到的结果是soluble 和inclusion body(目标蛋白质比较多)都有 : 因此我将诱导後的菌液离心收pellet後 用native binding buffer : 去用Freanch press破菌 然後再用13000rpm,10min 离心後取上清 通一管column : 得到上面的结果 pellet的部分 我用含有8M urea去回溶 之後wash elute都是用 : 根native一样的buffer但是整体的杂蛋白质和目标蛋白质都很少 是为什麽呢? : 照一开始破菌後跑胶的结果 应该是inclsion body的目标蛋白质比较多压?? : 怎麽通过column出来反而少呢? : 感谢各位 我们家是用FPLC搭配管柱使用 管柱体积比原PO的稍微大一点 我的作法是在外边把resin加热到50度上下真空去气 然後在把前面含有的Ni离子全部洗脱(EDTA) 再重新recharge loading的时候是直接把样品通入管柱(这一点和原PO不大一样) 老板有说过原PO的方法似乎不是很理想,理由我忘记了(老师在讲没在听) Elute的时候我们会先用10%的elution buffer elute大概6倍管柱体积(我会洗到七八倍) 不我一时想不起来是用多少浓度的imidazole去洗非专一性的protein 真的要试试看的话再寄信给我 当然诚如推文所建议 拉梯度会很好 至於inclusion body 我记得原PO前文提到是用pET system pET system mannual有inclusion body处理的方法~ --

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