請問各位 小妹最近要將表現的蛋白質利用Ni-NTA column純化出來 我的步驟是 1.先packing lml的resin 2.用10 ml ddH2O wash 3.用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) 4.通入sample 和resin均勻混合10mins(置入冰箱) 反覆binding三次 5.加入10 ml binding buffer 6.加入10 ml wash buffer(含有20mM imidazole) 7.加入10 ml elute buffer(含有250mM imidazole) 8.加入用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) 9.用10 ml ddH2O wash 10.置換20% EtOH保存column 可是Elute出來超多雜band 所以我就用elute出來確定有target protein的兩管 混合在一起 然後再通一次column 這次有將wash的 imidazole 濃度提高到50mM 這是Elute出來的雜band就有比較少 可是還是有兩條雜band 但是將對的目標蛋白質的量也比較少 而通第二次column後的wash我也有跑膠 都沒有任何的band出現 請問各位 如果我之後要再通column 可是直接在wash 的部分改變imidazloe的濃度嗎? 像是50mM收5ml 75mM收5ml 100mM收5ml然後再用 250mM去elute 這樣可行嗎? 還有一點很怪的是 我之前有取破菌後的上清和pellet來跑膠 得到的結果是soluble 和inclusion body(目標蛋白質比較多)都有 因此我將誘導後的菌液離心收pellet後 用native binding buffer 去用Freanch press破菌 然後再用13000rpm,10min 離心後取上清 通一管column 得到上面的結果 pellet的部分 我用含有8M urea去回溶 之後wash elute都是用 根native一樣的buffer但是整體的雜蛋白質和目標蛋白質都很少 是為什麼呢? 照一開始破菌後跑膠的結果 應該是inclsion body的目標蛋白質比較多壓?? 怎麼通過column出來反而少呢? 感謝各位 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.49.158