请问各位 小妹最近要将表现的蛋白质利用Ni-NTA column纯化出来 我的步骤是 1.先packing lml的resin 2.用10 ml ddH2O wash 3.用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) 4.通入sample 和resin均匀混合10mins(置入冰箱) 反覆binding三次 5.加入10 ml binding buffer 6.加入10 ml wash buffer(含有20mM imidazole) 7.加入10 ml elute buffer(含有250mM imidazole) 8.加入用10 ml binding buffer(含有5mM imidazole) 9.用10 ml ddH2O wash 10.置换20% EtOH保存column 可是Elute出来超多杂band 所以我就用elute出来确定有target protein的两管 混合在一起 然後再通一次column 这次有将wash的 imidazole 浓度提高到50mM 这是Elute出来的杂band就有比较少 可是还是有两条杂band 但是将对的目标蛋白质的量也比较少 而通第二次column後的wash我也有跑胶 都没有任何的band出现 请问各位 如果我之後要再通column 可是直接在wash 的部分改变imidazloe的浓度吗? 像是50mM收5ml 75mM收5ml 100mM收5ml然後再用 250mM去elute 这样可行吗? 还有一点很怪的是 我之前有取破菌後的上清和pellet来跑胶 得到的结果是soluble 和inclusion body(目标蛋白质比较多)都有 因此我将诱导後的菌液离心收pellet後 用native binding buffer 去用Freanch press破菌 然後再用13000rpm,10min 离心後取上清 通一管column 得到上面的结果 pellet的部分 我用含有8M urea去回溶 之後wash elute都是用 根native一样的buffer但是整体的杂蛋白质和目标蛋白质都很少 是为什麽呢? 照一开始破菌後跑胶的结果 应该是inclsion body的目标蛋白质比较多压?? 怎麽通过column出来反而少呢? 感谢各位 --

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