作者vstephen (無情者傷人命)
看板Biotech
標題[求救] 如何去掉plasmid上特定序列?
時間Sat May 22 21:09:59 2010
因為小弟對分生實驗不是很熟,想請問板上各位板友,
如果我有一個實驗室前人construct好的plasmid,
(amp resist, circular, total~6.5k)
因為實驗設計,我想去掉其中一段約100bp (100bp兩邊無re可切)
不知道有什麼辦法呢?
我目前想到的是PCR, 用primer把要的區域夾出來,
再用blunt end ligation~
不知道這樣可不可行呢?
還是大家有更好的建議嗎@@
謝謝回答囉^^!
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◆ From: 140.114.202.116
1F：→ blence:照你的方法,primer的5'要加磷酸,不然linear接不起來,而且此 05/22 21:21
2F：→ blence:form又會跟原本template在跑膠時幾乎同大小,難以純化 05/22 21:22
3F：→ blence:用site-direct mutagenesis method就好了 05/22 21:24
4F：推 dodomilk:site-direct可以一次去掉100bp!? 05/22 21:50
5F：→ dodomilk:我想到的一樣是用primer夾 兩個primer尾端設計同一個re 05/22 21:52
6F：→ dodomilk:p出來後用re切掉再接起來 再用site-direct去掉 05/22 21:53
7F：→ dodomilk:另外, p出來的是線型, 和環形的template跑膠應該分得吧？ 05/22 21:55
8F：推 milkpa:用樓上do的方法是一般常用的（我們實驗室常在做這類事情） 05/22 22:08
9F：→ milkpa:用primer加上適當的切位，並利用DpnI將plasmid切除，可以 05/22 22:09
10F：→ milkpa:避免有太高的背景值 05/22 22:09
11F：→ blence:數百bp跟2~5bp都一樣做法,最長做過1.5k,直接把基因中段砍掉 05/22 22:33
12F：→ vstephen:我現在大概有些頭緒了~ 多謝你們的回答啦! 05/22 23:34
13F：推 icome:site-direct可以啊 05/23 06:24
14F：推 childchen:用PCR sewing的方法就可以啦 05/23 10:56
15F：推 SugarSa:樓上方不方便介紹一下PCR sewing? 05/23 17:24