作者vstephen (无情者伤人命)
看板Biotech
标题[求救] 如何去掉plasmid上特定序列?
时间Sat May 22 21:09:59 2010
因为小弟对分生实验不是很熟,想请问板上各位板友,
如果我有一个实验室前人construct好的plasmid,
(amp resist, circular, total~6.5k)
因为实验设计,我想去掉其中一段约100bp (100bp两边无re可切)
不知道有什麽办法呢?
我目前想到的是PCR, 用primer把要的区域夹出来,
再用blunt end ligation~
不知道这样可不可行呢?
还是大家有更好的建议吗@@
谢谢回答罗^^!
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◆ From: 140.114.202.116
1F：→ blence:照你的方法,primer的5'要加磷酸,不然linear接不起来,而且此 05/22 21:21
2F：→ blence:form又会跟原本template在跑胶时几乎同大小,难以纯化 05/22 21:22
3F：→ blence:用site-direct mutagenesis method就好了 05/22 21:24
4F：推 dodomilk:site-direct可以一次去掉100bp!? 05/22 21:50
5F：→ dodomilk:我想到的一样是用primer夹 两个primer尾端设计同一个re 05/22 21:52
6F：→ dodomilk:p出来後用re切掉再接起来 再用site-direct去掉 05/22 21:53
7F：→ dodomilk:另外, p出来的是线型, 和环形的template跑胶应该分得吧？ 05/22 21:55
8F：推 milkpa:用楼上do的方法是一般常用的（我们实验室常在做这类事情） 05/22 22:08
9F：→ milkpa:用primer加上适当的切位，并利用DpnI将plasmid切除，可以 05/22 22:09
10F：→ milkpa:避免有太高的背景值 05/22 22:09
11F：→ blence:数百bp跟2~5bp都一样做法,最长做过1.5k,直接把基因中段砍掉 05/22 22:33
12F：→ vstephen:我现在大概有些头绪了~ 多谢你们的回答啦! 05/22 23:34
13F：推 icome:site-direct可以啊 05/23 06:24
14F：推 childchen:用PCR sewing的方法就可以啦 05/23 10:56
15F：推 SugarSa:楼上方不方便介绍一下PCR sewing? 05/23 17:24