※ 引述《DJHINN (dj)》之銘言： : 發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 : 以方便板友幫您追蹤問題 : ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- : 我要將 差不多 6.3k的 PCR product insert 入 3.6 K的 TA vector : 但是 頻頻失敗 : 目前用過的 莫耳比為 : 6.3K product : 3.6K vector = 1:3 : 我是將 vector 當作 insert看待 : 因為 product>>>>> vector : 但是 仍是失敗 : 有學姊是比較反其道而行 : 他的比例是 : 6K product : 3K vector = 8 : 1 (接下來會試看看) : 做出來了， 可是我不知道 其理論是甚麼!? : 請有做過類似實驗的大大 給個幫助一下 ~"~ 做 Vector Cloning 完全屬於雖小 不管你的 insert 跟 vector 怎麼比例 一定要剛剛好 insert 碰到 vector 的切點，再加上剛好 ligase 再旁邊 還要剛剛好有個 ATP 在旁邊，這幾個東西同時出現在同一個發生點上 ligation 才會成功 我不知道您的 TA-cloning 是用哪一個 kit 就我試過最方便的是 invitrogene 出的 我記得應該有個步驟是 room temp. 放個 10 分鐘還是多少 就是你把所有東西都喇在一起後的那個步驟， 試試看延長到30分鐘或20分鐘，時間增長，增加這些東西碰在一起的機會 說穿了做 ligation 做 transformation 事實上跟技術無關。都掌控在細菌他自己的狀態 competent cell preparation 洗久一點，細胞膜就破破爛爛 plasmid intake 就比較多，但是recovery 不好 或是有人用 heat shock 90 秒做的出來 換個人就要用 40 秒才可以 若是用 elecroporation 的方法，細菌跟 plasmid 的溶液鹽類就不可以太高 不然就爆爆樂 一我的經驗就是抓個中間直，自己慢慢試 東西做出來比較重要，試試看實驗室有經驗的人的方法 試著去體會 know why is more important than know how 會對於您解決問題上有很大的幫助 小小經驗，希望對您有幫助，您可以參考看看。 --

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