※ 引述《DJHINN (dj)》之铭言： : 发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出 : 以方便板友帮您追踪问题 : ----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章---- : 我要将 差不多 6.3k的 PCR product insert 入 3.6 K的 TA vector : 但是 频频失败 : 目前用过的 莫耳比为 : 6.3K product : 3.6K vector = 1:3 : 我是将 vector 当作 insert看待 : 因为 product>>>>> vector : 但是 仍是失败 : 有学姊是比较反其道而行 : 他的比例是 : 6K product : 3K vector = 8 : 1 (接下来会试看看) : 做出来了， 可是我不知道 其理论是甚麽!? : 请有做过类似实验的大大 给个帮助一下 ~"~ 做 Vector Cloning 完全属於虽小 不管你的 insert 跟 vector 怎麽比例 一定要刚刚好 insert 碰到 vector 的切点，再加上刚好 ligase 再旁边 还要刚刚好有个 ATP 在旁边，这几个东西同时出现在同一个发生点上 ligation 才会成功 我不知道您的 TA-cloning 是用哪一个 kit 就我试过最方便的是 invitrogene 出的 我记得应该有个步骤是 room temp. 放个 10 分钟还是多少 就是你把所有东西都喇在一起後的那个步骤， 试试看延长到30分钟或20分钟，时间增长，增加这些东西碰在一起的机会 说穿了做 ligation 做 transformation 事实上跟技术无关。都掌控在细菌他自己的状态 competent cell preparation 洗久一点，细胞膜就破破烂烂 plasmid intake 就比较多，但是recovery 不好 或是有人用 heat shock 90 秒做的出来 换个人就要用 40 秒才可以 若是用 elecroporation 的方法，细菌跟 plasmid 的溶液盐类就不可以太高 不然就爆爆乐 一我的经验就是抓个中间直，自己慢慢试 东西做出来比较重要，试试看实验室有经验的人的方法 试着去体会 know why is more important than know how 会对於您解决问题上有很大的帮助 小小经验，希望对您有帮助，您可以参考看看。 --

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