作者ricebaby (小蘋兒)
看板Biotech
標題[求救] 請教關於BL21(DE3)pLysS破細胞的方法
時間Mon May 17 20:59:52 2010
小妹近日在作蛋白質表現
是將我的insert接到pET20b(+)然後再轉型到BL21(DE3)pLysS作蛋白質表現
我的作法是
先加入1/100 over night的菌液培養在37度refresh到OD=0.4--0.6
然後加入0.1mM的IPTG於25度培養六小時,100rpm
離心去掉上清液加入sample loading dye
在沸水中煮10分鐘 然後去跑10% SDS-PAGE
可以看到很明顯的induction結果
作Western也確定那就是我要的protein
可是之後作大量約300ml培養條件一樣
然後一樣離心去掉上清液後加入15mlextraction buffer混合均勻
去打sonication 打10s'停10s'總共打1hr
在上清的部分有看到我要得蛋白質(可以濃度很低)
可是在pellet的部分也有看到我要的蛋白質><
這是破菌破的不完全嗎?要怎麼樣才可以破菌破的比較完全呢?
我之後會通Ni-NTA column來純化我要的蛋白質
還是我可以直接加入native binding buffer去打sonication呢?
這樣效果會比較好嗎?
感謝各位
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.49.158
1F：→ milkpa:inclusion body 05/17 21:03
2F：→ spirithorse:你的protein該不會是要純化做antibody吧(菸) 05/17 21:29
3F：→ ksn:有inclusion body就會玩到爆炸了..antibody有考慮細胞生產嗎? 05/17 21:52
4F：→ ricebaby:是要純化做antibody的!!!可是上清也很清楚有我要的蛋白質 05/17 22:58
5F：推 BLACKOA:French press會比較好,誘導前,先在25度c30分鐘,再加IPTG 05/17 23:01
6F：推 kshsdeck:sonication效果有限 尤其是放大規模後 05/17 23:31
7F：→ kshsdeck:eppendorf打的破 同樣條件在離心管不一定破的完全 05/17 23:32
8F：→ kshsdeck:french press效果會好很多 05/17 23:33
9F：→ kshsdeck:在小量的時候,就應該先拿去sonicate,確定蛋白可不可溶 05/17 23:35
10F：→ kshsdeck:小量induction確定蛋白可溶,再考慮是不是破菌方法不夠好 05/17 23:37
11F：推 kshsdeck:小量確定不溶的話,調整IPTG濃度,溫度,induction時O.D600 05/17 23:41
12F：→ kshsdeck:再不行就換vector和Host 05/17 23:41
13F：推 kshsdeck:補充一點 如果是破菌的問題,又沒有辦法借到French press 05/17 23:44
14F：→ kshsdeck:可以先Freeze&Thaw幾次,或是加Lysozyme 05/17 23:45
15F：→ kshsdeck:這樣前處理完,就已經可以看到稠稠的DNA跑出來了 05/17 23:47
16F：推 aimin:可以試試用urea 然後在慢慢置換回原本的buffer 05/18 00:53
17F：推 spirithorse:推三樓 有inclusion body就會玩到爆炸了!!! 05/18 18:56
18F：推 tsubasawolfy:IB本身就不是正確的folding 上清有你要的也白搭 05/19 11:46