作者ricebaby (小苹儿)
看板Biotech
标题[求救] 请教关於BL21(DE3)pLysS破细胞的方法
时间Mon May 17 20:59:52 2010
小妹近日在作蛋白质表现
是将我的insert接到pET20b(+)然後再转型到BL21(DE3)pLysS作蛋白质表现
我的作法是
先加入1/100 over night的菌液培养在37度refresh到OD=0.4--0.6
然後加入0.1mM的IPTG於25度培养六小时,100rpm
离心去掉上清液加入sample loading dye
在沸水中煮10分钟 然後去跑10% SDS-PAGE
可以看到很明显的induction结果
作Western也确定那就是我要的protein
可是之後作大量约300ml培养条件一样
然後一样离心去掉上清液後加入15mlextraction buffer混合均匀
去打sonication 打10s'停10s'总共打1hr
在上清的部分有看到我要得蛋白质(可以浓度很低)
可是在pellet的部分也有看到我要的蛋白质><
这是破菌破的不完全吗?要怎麽样才可以破菌破的比较完全呢?
我之後会通Ni-NTA column来纯化我要的蛋白质
还是我可以直接加入native binding buffer去打sonication呢?
这样效果会比较好吗?
感谢各位
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.49.158
1F：→ milkpa:inclusion body 05/17 21:03
2F：→ spirithorse:你的protein该不会是要纯化做antibody吧(菸) 05/17 21:29
3F：→ ksn:有inclusion body就会玩到爆炸了..antibody有考虑细胞生产吗? 05/17 21:52
4F：→ ricebaby:是要纯化做antibody的!!!可是上清也很清楚有我要的蛋白质 05/17 22:58
5F：推 BLACKOA:French press会比较好,诱导前,先在25度c30分钟,再加IPTG 05/17 23:01
6F：推 kshsdeck:sonication效果有限 尤其是放大规模後 05/17 23:31
7F：→ kshsdeck:eppendorf打的破 同样条件在离心管不一定破的完全 05/17 23:32
8F：→ kshsdeck:french press效果会好很多 05/17 23:33
9F：→ kshsdeck:在小量的时候,就应该先拿去sonicate,确定蛋白可不可溶 05/17 23:35
10F：→ kshsdeck:小量induction确定蛋白可溶,再考虑是不是破菌方法不够好 05/17 23:37
11F：推 kshsdeck:小量确定不溶的话,调整IPTG浓度,温度,induction时O.D600 05/17 23:41
12F：→ kshsdeck:再不行就换vector和Host 05/17 23:41
13F：推 kshsdeck:补充一点 如果是破菌的问题,又没有办法借到French press 05/17 23:44
14F：→ kshsdeck:可以先Freeze&Thaw几次,或是加Lysozyme 05/17 23:45
15F：→ kshsdeck:这样前处理完,就已经可以看到稠稠的DNA跑出来了 05/17 23:47
16F：推 aimin:可以试试用urea 然後在慢慢置换回原本的buffer 05/18 00:53
17F：推 spirithorse:推三楼 有inclusion body就会玩到爆炸了!!! 05/18 18:56
18F：推 tsubasawolfy:IB本身就不是正确的folding 上清有你要的也白搭 05/19 11:46