作者sunnyforever ( )
看板Biotech
標題[求救] 抽cell line genomic DNA
時間Mon May 17 18:45:42 2010
我用的是傳統phenol:chloroform:IAA的方法。
步驟大致如下，
1.將dish裡medium倒掉，加入PBS wash兩次，
2.直接加入lysis buffer到dish，將cell輕輕刮下收到eppendorf
3.incubate at 52度 for 4hr,
4.加入等量PCI，invert 10分鐘,離心25分鐘
5.吸上清液 再加入等量chloroform 離心20min
6.加sodium acetate 等倍isopropanol -20 overnight
7.離心25分鐘 RT
8.吸棄上清液 用70% ethanol wash 兩次 每次3~5分鐘 離心20分鐘
9.RT晾乾, ddH2O回溶 放55度數小時 冰-20
依上述實驗步驟 只過一次PCI依然會殘留很多蛋白，
老師說lysis buffer裡面 proteinaseK量下重一點 incubate久一點
可是後來我這樣做以後gDNA跑膠卻smear,
再過一次PCI 或是 chloroform也是會有smear的情形
再抽的過程DNA也會像鼻涕一樣黏稠 每次離心或是回溶都很不好溶
過PCI後要吸上清液也是很難吸 會牽帶一些蛋白上來
酒精wash也會放段時間或是多洗幾次才會沉澱
想請問
1.proteinaseK的量或是incubate的時間會使DNA斷裂嗎
2.多過幾次PCI或是chloroform會造成DNA斷裂嗎
3.離心的時間太久或是酒精wash時間和次數會影響嗎
4.回溶要怎麼回溶DNA才會溶得好呢
5.另外再鹽類沉澱的步驟後用tip撈會比較乾淨嗎?
另外我問其他抽過的人 她們說以前抽Cell line的gDNA並沒有像我抽到這樣黏稠狀
請有經驗的大大可以指導一下~感謝~
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◆ From: 140.116.25.156
※ 編輯: sunnyforever 來自: 140.116.25.156 (05/17 19:00)
1F：→ ko363630:小弟曾抽過gDNA(fungi) 有聽過chloroform會斷DNA 05/17 21:50
2F：→ ko363630:酒精wash跟離心時間不會影響太多 如果你要保存就用TE 05/17 21:51
3F：→ ko363630:-Buffer 如果要做後續實驗就用ddH2O 想問為什麼不用RNase 05/17 21:52
4F：→ ko363630:雖然我也是用傳統法(非IAA) 但是我都會加RNase(確保水解R 05/17 21:54
5F：→ ko363630:RNA、proteinase K(PCI切不夠) 其他步驟都跟你差不多 05/17 21:56