作者sunnyforever ( )
看板Biotech
标题[求救] 抽cell line genomic DNA
时间Mon May 17 18:45:42 2010
我用的是传统phenol:chloroform:IAA的方法。
步骤大致如下，
1.将dish里medium倒掉，加入PBS wash两次，
2.直接加入lysis buffer到dish，将cell轻轻刮下收到eppendorf
3.incubate at 52度 for 4hr,
4.加入等量PCI，invert 10分钟,离心25分钟
5.吸上清液 再加入等量chloroform 离心20min
6.加sodium acetate 等倍isopropanol -20 overnight
7.离心25分钟 RT
8.吸弃上清液 用70% ethanol wash 两次 每次3~5分钟 离心20分钟
9.RT晾乾, ddH2O回溶 放55度数小时 冰-20
依上述实验步骤 只过一次PCI依然会残留很多蛋白，
老师说lysis buffer里面 proteinaseK量下重一点 incubate久一点
可是後来我这样做以後gDNA跑胶却smear,
再过一次PCI 或是 chloroform也是会有smear的情形
再抽的过程DNA也会像鼻涕一样黏稠 每次离心或是回溶都很不好溶
过PCI後要吸上清液也是很难吸 会牵带一些蛋白上来
酒精wash也会放段时间或是多洗几次才会沉淀
想请问
1.proteinaseK的量或是incubate的时间会使DNA断裂吗
2.多过几次PCI或是chloroform会造成DNA断裂吗
3.离心的时间太久或是酒精wash时间和次数会影响吗
4.回溶要怎麽回溶DNA才会溶得好呢
5.另外再盐类沉淀的步骤後用tip捞会比较乾净吗?
另外我问其他抽过的人 她们说以前抽Cell line的gDNA并没有像我抽到这样黏稠状
请有经验的大大可以指导一下~感谢~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.156
※ 编辑: sunnyforever 来自: 140.116.25.156 (05/17 19:00)
1F：→ ko363630:小弟曾抽过gDNA(fungi) 有听过chloroform会断DNA 05/17 21:50
2F：→ ko363630:酒精wash跟离心时间不会影响太多 如果你要保存就用TE 05/17 21:51
3F：→ ko363630:-Buffer 如果要做後续实验就用ddH2O 想问为什麽不用RNase 05/17 21:52
4F：→ ko363630:虽然我也是用传统法(非IAA) 但是我都会加RNase(确保水解R 05/17 21:54
5F：→ ko363630:RNA、proteinase K(PCI切不够) 其他步骤都跟你差不多 05/17 21:56