作者enolam (戀愛的感覺 回來ꐩ
看板Biotech
標題[求救] 請問有人做過磷酸化的AMPK嗎?
時間Fri May 14 11:39:12 2010
我近來嘗試著再做AMP-activated protein kinase (AMPK)
他是一個與能量代謝有關的蛋白質，需要被磷酸化後(pAMPK)才會具有活性
可是做了一個月pAMPK的band都非常的弱，不知道有沒有哪位版友能提供一
下解決的方法，我的一些步驟條件大致如下:
Transfer: semi-dry, 250 mA, 30 mins
Blocking: 3% BSA, 2 hrs
First Ab: 1:800, O/N (cell signalling, diluted in 3% BSA)
Second Ab: anti-rabbit, 1/30000, 1 hr (cell signalling,
diluted in 5% skim milk)
在搖完一抗和二抗後皆以含0.2% Tween-20的TBST清洗三次
結束上述過程後進暗房壓片，無論壓多久band都很弱ˊˋ，感覺band看得出來不細
但是就是很淡。
再麻煩各位先進給些建議了。
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◆ From: 210.60.122.10
1F：推 ooooh:可以在buffer內加1mM NaF 訊號會比較強 05/14 20:59
2F：推 jethuang:二抗用濃一點看看,改1:10000或1:5000試試!! 05/15 09:10
3F：推 lusaren:建議你一抗可以在4C下放個兩天! 訊號會很漂亮! 05/18 20:28
4F：→ lusaren:如果還是很淡! 就要增加蛋白loading的量! 05/18 20:29
5F：→ chaunen:blocking時牛奶或BSA越濃or時間越久, 其實會對你的signal 05/19 03:58
6F：→ chaunen:產生影響, 多少也把該有的band覆蓋掉一些 05/19 04:00
7F：→ chaunen:1抗時使用的BSA or牛奶濃度當然也會有相同的影響 05/19 04:01
8F：→ chaunen:所以同j大說的2抗已經很稀了(?) 又加上5% 的milk 05/19 04:05
9F：→ chaunen:tween20可 改成0.1% 太多也是會影響Ab 的binding能力 05/19 04:08
10F：→ chaunen:如果你要看的protein 表現亮本來就不太多 05/19 04:09
11F：→ chaunen:也可以考慮不要收核(不過我想AMPK應該很多才是XD") 05/19 04:25