作者enolam (恋爱的感觉 回来ꐩ
看板Biotech
标题[求救] 请问有人做过磷酸化的AMPK吗?
时间Fri May 14 11:39:12 2010
我近来尝试着再做AMP-activated protein kinase (AMPK)
他是一个与能量代谢有关的蛋白质，需要被磷酸化後(pAMPK)才会具有活性
可是做了一个月pAMPK的band都非常的弱，不知道有没有哪位版友能提供一
下解决的方法，我的一些步骤条件大致如下:
Transfer: semi-dry, 250 mA, 30 mins
Blocking: 3% BSA, 2 hrs
First Ab: 1:800, O/N (cell signalling, diluted in 3% BSA)
Second Ab: anti-rabbit, 1/30000, 1 hr (cell signalling,
diluted in 5% skim milk)
在摇完一抗和二抗後皆以含0.2% Tween-20的TBST清洗三次
结束上述过程後进暗房压片，无论压多久band都很弱ˊˋ，感觉band看得出来不细
但是就是很淡。
再麻烦各位先进给些建议了。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.10
1F：推 ooooh:可以在buffer内加1mM NaF 讯号会比较强 05/14 20:59
2F：推 jethuang:二抗用浓一点看看,改1:10000或1:5000试试!! 05/15 09:10
3F：推 lusaren:建议你一抗可以在4C下放个两天! 讯号会很漂亮! 05/18 20:28
4F：→ lusaren:如果还是很淡! 就要增加蛋白loading的量! 05/18 20:29
5F：→ chaunen:blocking时牛奶或BSA越浓or时间越久, 其实会对你的signal 05/19 03:58
6F：→ chaunen:产生影响, 多少也把该有的band覆盖掉一些 05/19 04:00
7F：→ chaunen:1抗时使用的BSA or牛奶浓度当然也会有相同的影响 05/19 04:01
8F：→ chaunen:所以同j大说的2抗已经很稀了(?) 又加上5% 的milk 05/19 04:05
9F：→ chaunen:tween20可 改成0.1% 太多也是会影响Ab 的binding能力 05/19 04:08
10F：→ chaunen:如果你要看的protein 表现亮本来就不太多 05/19 04:09
11F：→ chaunen:也可以考虑不要收核(不过我想AMPK应该很多才是XD") 05/19 04:25