作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問有人用過中研院lentivirus express …
時間Thu May 13 12:08:39 2010
這支lentiviral vector好像不好做
最近把midi抽出來的plasmid拿去跑膠 才發現plasmid跟本就有問題
其中四個跑出來只有200bp有band
另外一個放大的空vector是比原本的稍小 但是也多了200bp的鬼東西
但當初mini prepare出來的plasmid是正確的!!同樣的菌拿去放大就出問題!!
查了一些資料 說LTR很容易讓plasmid發生recombination!
我用的是DH5alpha
其他實驗室的人說 他們都是用stbl3做的...
不知道有沒有人有類似經驗?
: : 我目前用中研院給的pLKO AS2.neo做virus
: : 外源基因有成功接入
: : 用LNCaP當作被感染的細胞
: : 經感染後用G418處理約三天 沒有看到細胞有死亡的現象
: : 且細胞型態有所改變 和使用shRNA病毒感染的狀況一樣
: : (變得較細長 因為對照組也有同樣狀態故應是一般狀況)
: : 但是跑Western卻看不到所要表現的蛋白!!
: : 一開始認為是cloning出問題 可能是frame shift
: : 但是四組實驗組(獨立的construct)都同樣狀況 我當初用Pfu 效果應該不會這麼糟!
: : 總之我會拿去定序 如果真的是四組都frame shift那也真是太賽了.. = =
: : 我想請問的是 如果不是construct出錯 可能是哪裡有問題呢?
: : 目前是猜測titer太低...但如果是MOI太低 在G418 selection時應該很多細胞死掉才對?
: : 怎麼樣都想不透啊.......有人用這套系統成功表現過嗎? 感謝回答!
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◆ From: 140.112.121.97
1F：推 aceliang:DH5alpha真的是卯起來recomb.，上次挑十顆錯兩顆...Orz 05/13 12:21
2F：推 Fourfish:之前有看到類似的文章 有人說要用stbl3才行 05/13 12:46
3F：→ icome:好像跟size有關 size比較小的像是shRNA不容易發生 05/14 18:21
4F：推 longko:目前我中量抽出來DNA都沒問題耶~我是用DH5a~目前Lentivirus 05/15 22:20
5F：推 longko:感染的細胞有成功knockdown protein 在第五天測試的 05/15 22:28
6F：→ icome:樓上 我shRNA也是抽了快兩年都沒問題 一換成cDNA就不行了 05/16 15:12